O coloração de esporos É a metodologia utilizada para colorir as estruturas de resistência que formam alguns gêneros bacterianos quando estão em condições desfavoráveis; essas estruturas correspondem a uma forma de sobrevivência.
Existem muitos gêneros que formam esporos; no entanto, os principais são Bacillus e Clostridium. Esses gêneros são considerados mais relevantes por apresentarem espécies patogênicas para o homem..
Cada bacilo pode dar origem a um esporo. No momento da coloração da preparação, o esporo pode ser encontrado dentro do bacilo (endosporo) ou fora dele (exosporo). Com técnicas de coloração convencionais para bactérias - como a coloração de Gram - os esporos permanecem incolores.
Atualmente, existem várias metodologias de coloração que são capazes de penetrar na estrutura espessa do esporo para tingi-lo. Essas metodologias são muito variadas; Isso inclui a técnica Dorner, a coloração Möeller e a metodologia Shaeffer-Fulton, também conhecida como Wirtz-Conklin..
De todas as técnicas mencionadas, a metodologia Shaeffer-Fulton é a mais utilizada em laboratórios de rotina. Tem o nome de dois microbiologistas que criaram a coloração em 1930: Alicia Shaeffer e MacDonald Fulton. No entanto, a técnica é às vezes chamada de Wirtz-Conklin em homenagem a dois bacteriologistas do século XX..
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Os esporos não se coram com as manchas convencionais porque têm uma parede muito espessa. A complexa composição dos esporos impede a entrada da maioria dos corantes.
Se o esporo é estudado de fora para dentro, as seguintes camadas são observadas: primeiro é o exosporium, que é a camada mais fina e externa formada por glicoproteínas.
Em seguida, vem a cutícula, que oferece resistência a altas temperaturas, seguida pelo córtex composto por peptidoglicano. Depois é a parede da base que protege o protoplasto.
O esporo é uma estrutura desidratada que contém 15% de cálcio e ácido dipicolínico. Por esta razão, a maioria das técnicas de coloração de esporos dependem da aplicação de calor para que o corante possa penetrar na estrutura espessa..
Uma vez que o esporo é manchado, ele não pode remover o corante. Na técnica de Shaeffer-Fulton, o verde malaquita entra nas células vegetativas e, quando o calor é aplicado, penetra no endosporo e exosporos também..
Ao lavar com água, o corante é removido da célula vegetativa. Isso ocorre porque o corante verde malaquita é ligeiramente básico, por isso se liga fracamente à célula vegetativa..
Em vez disso, não consegue sair do esporo e o bacilo acaba sendo contrastado com safranina. Este fundamento é válido para o resto das técnicas, nas quais algo semelhante acontece.
Para realizar a coloração de esporos, você deve ter uma cultura pura da cepa suspeita que deseja estudar..
A cultura é submetida a temperaturas extremas por 24 horas para estimular a esporulação do microrganismo. Para isso, a cultura pode ser levada à estufa a 44 ° C ou à geladeira (8 ° C) por 24 ou 48 horas..
Se permanecer muito tempo nas temperaturas mencionadas, apenas exosporos serão observados, uma vez que todos os endosporos já terão saído do bacilo..
Ao final do tempo, algumas gotas de solução fisiológica estéril devem ser colocadas em uma lâmina limpa. Em seguida, uma pequena porção da cultura é colhida e uma boa distribuição é feita.
Em seguida, é deixado para secar, cozido no calor e tingido com uma das técnicas explicadas a seguir:
1- Prepare uma suspensão concentrada do microrganismo esporulado em água destilada em um tubo de ensaio e adicione igual volume de carbol fucsina Kinyoun filtrada.
2- Coloque o tubo em um banho de água fervente por 5 a 10 minutos.
3- Em uma lâmina limpa, misture uma gota da suspensão anterior com uma gota de solução aquosa de nigrosina a 10% fervida e filtrada..
4- Espalhe e seque rapidamente com calor suave.
5- Examine com objetiva 100X (imersão).
Os esporos coram de vermelho e as células bacterianas parecem quase incolores contra um fundo cinza escuro.
1- Uma suspensão do microrganismo esporulado é espalhada em uma lâmina e fixada no calor.
2- A amostra é coberta com uma tira de papel de filtro à qual se adiciona fucsina carbólica. O corante é aquecido por 5 a 7 minutos com a chama do bico de Bunsen até que a evolução dos vapores seja gerada. Em seguida, o papel é removido.
3- A preparação é lavada com água e depois seca com papel absorvente.
4- Cubra o esfregaço com uma película fina de nigrosina a 10%, usando uma segunda lâmina para espalhar a nigrosina ou uma agulha.
A coloração que os esporos e bactérias assumem é a mesma que a descrita na técnica anterior.
1- Faça um esfregaço fino com uma suspensão do microrganismo esporulado em uma lâmina e fixe ao calor.
2- Cubra a lâmina com solução aquosa de verde malaquita a 5% (um papel de filtro pode ser colocado na lâmina).
3- Aquecer sobre a chama do bico de Bunsen para provocar a liberação de vapores e remover a chama. Repita a operação por 6 a 10 minutos. Se a solução de malaquita verde evaporar muito durante o procedimento, mais.
4- Remova o papel de filtro (se instalado) e lave com água.
5- Cubra a lâmina com safranina aquosa 0,5% por 30 segundos (algumas variantes da técnica usam safranina aquosa 0,1% e deixe por 3 minutos).
Com esta técnica, os esporos aparecem verdes e os bacilos vermelhos..
Tem a desvantagem de que os endosporos de culturas jovens não se coram bem, pois parecem extremamente límpidos ou incolores. Para evitar isso, recomenda-se o uso de culturas de 48 horas de incubação..
1- Cubra o esfregaço com clorofórmio por 2 minutos.
2- Descarte o clorofórmio.
3- Cubra com ácido crômico a 5% por 5 minutos.
4- Lave com água destilada
5- A lâmina é recoberta com carbol fucsina-fenicada e exposta à chama do bico de Bunsen até a emissão dos vapores; em seguida, ele é removido da chama por alguns momentos. A operação é repetida até que 10 minutos sejam concluídos.
6- Lavar com água.
7- Use etanol acidificado (álcool clorídrico) para descolorir. Deixe por 20 ou 30 segundos.
8- Lavar com água destilada.
9- Contrastar cobrindo a folha com azul de metileno por 5 minutos.
10- Lavar com água destilada.
11- Deixe secar e leve a amostra ao microscópio.
Os esporos aparecem em vermelho e os bacilos em azul. É importante não respirar os vapores, pois são tóxicos e, a longo prazo, podem ser cancerígenos..
Em 2007, Hayama e seus colaboradores criaram uma modificação da técnica Möeller. Eles eliminaram a etapa de aquecimento do corante e o substituíram adicionando 2 gotas do surfactante Tergitol 7 para cada 10 ml de solução de carbol fucsina-carbol. Os mesmos resultados foram obtidos.
A coloração de esporos fornece informações muito valiosas e úteis para a identificação do patógeno, uma vez que sua presença, sua forma, localização dentro do bacilo e a capacidade de deformar ou não a célula vegetativa, são dados que podem orientar as espécies. certo gênero.
Neste contexto, vale dizer que os esporos podem ser redondos ou ovais, podem estar localizados no centro ou também em posição paracentral, subminal ou terminal..
- Clostridium difficile forma um esporo oval na posição terminal que deforma o bacilo.
- O esporo de Clostridium tertium é oval, não deforma o bacilo e está localizado no nível terminal.
- O endosporo de Clostridium tetani é terminal e deforma o bacilo, dando a aparência de uma coxinha.
- Esporos de Clostridium botulinum, C. histolítico, C. novy Y C. septicum eles são subterminais redondos ou ovais e deformam o bacilo.
- O endosporo de Clostridium sordelli está localizado na posição central, com uma ligeira deformação.
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