O Teste Voges-Proskauer é um teste bioquímico usado para ajudar a identificar bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae. É especialmente útil para diferenciar cepas de Escherichia coli a partir de Klebsiella e Enterobacter, entre outras.
O teste é realizado em meio de cultura líquido denominado Methyl Red-Voges Proskauer, mais conhecido pela sigla RM / VP. Este meio é composto de polipeptona tamponada, glicose, fosfato dipotássico e água destilada..
O meio RM / VP atual é uma modificação do meio Clark e Lubs, que originalmente continha uma concentração mais baixa de peptonas e glicose. Portanto, menos íon de hidrogênio, necessário para a reação de Voges-Proskauer positiva, foi produzido..
O teste é baseado na capacidade do microrganismo de utilizar glicose pela rota do butilenoglicol, e formar um produto final neutro denominado acetoína, na presença de oxigênio e pH alcalino.
No meio RM / VP, além de ser capaz de revelar o teste de Voges-Proskauer, o teste de vermelho de metila também pode ser revelado.
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As pluripeptonas presentes no meio fornecem os requisitos nutricionais essenciais para o crescimento bacteriano. Por sua vez, a glicose é o principal composto. Muitas bactérias têm a capacidade de metabolizar a glicose e formar ácido pirúvico.
O ácido pirúvico é um ponto médio no metabolismo da glicose e a partir daí cada microrganismo pode seguir diferentes rotas. Alguns formarão ácidos mistos, como ácido lático, ácido acético, ácido fórmico e ácido succínico, e outros formarão produtos neutros como o 2,3-butanodiol..
O teste de Voges-Proskauer revela a capacidade do microrganismo de formar acetil metil carbinol (acetoína), um produto intermediário do 2,3-butanodiol em condições aeróbias.
A acetoína é reduzida e forma 2,3-butanodiol, mas essa reação é reversível; portanto, se o 2,3-butanodiol for oxidado, a acetoína é formada. Portanto, o oxigênio é essencial.
O fosfato dipotássico é o tampão que protege a mistura a pH 6,9 ± 0,2.
Para demonstrar a reação, deve-se realizar um desenvolvimento com dois reagentes (reagentes de Barrit), conhecidos como Voges A e Voges B.
Voges A é uma solução a 5% de α-naftol e Voges B é uma preparação de hidróxido de potássio a 40%. Se o hidróxido de potássio não estiver disponível, ele pode ser substituído por hidróxido de sódio a 40%.
O Α-naftol é um catalisador que aumenta a intensidade da cor da reação, tornando o teste mais sensível. O α-naftol deve ser adicionado sempre primeiro, agitando o tubo para que o meio entre em contato com o oxigênio. Dessa forma, a acetoína presente é oxidada a diacetil, e o 2,3-butanodiol é oxidado para formar acetoína, passando para diacetil..
É assim que o α-naftol se ligará ao diacetil, que por sua vez se juntou ao núcleo da guanidina presente no aminoácido arginina, este último proveniente das pluripeptonas..
Por sua vez, o potássio ou hidróxido de sódio é responsável pela absorção de COdois e de reagir com peptonas. Esta reação provoca a formação de uma cor rosa salmão, claramente visível após agitar muito bem o tubo..
Quantidades corretas de diacetil, peptona e α-naftol devem ser misturadas para que a cor ocorra instantaneamente. Se isso não acontecer, o tubo pode descansar por 15 minutos antes da interpretação..
Normalmente, o teste é positivo após 2 a 5 minutos, quando uma leve cor rosa pode ser vista. Se deixado em repouso por 30 min a 1 hora, a intensidade da cor será máxima (vermelho intenso).
Um teste negativo aparecerá quando o caldo ficar amarelo. Após 1 hora, se o teste for negativo, uma cor de cobre pode se formar como resultado da reação do hidróxido de potássio ao α-naftol.
Pesar 17 g do meio de cultura desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Deixe repousar por 5 minutos. Aqueça a fervura para dissolver completamente. Sirva de 3 a 4 ml em tubos e esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.
O meio de cultura desidratado é de cor bege e o meio preparado é de cor âmbar claro..
O pH final do meio é 6,9 ± 0,2.
Pesar 5 g de α-naftol e dissolver em 50 ml de álcool etílico (absoluto). Em seguida, continue adicionando álcool etílico até atingir 100 ml..
Pesar 40 g de hidróxido de potássio e dissolver em 50 ml de água destilada em um copo. O copo deve ser colocado em banho-maria para controlar a temperatura, pois quando o preparo é dissolvido a temperatura sobe bruscamente.
Após o resfriamento da solução, ela é transferida para um balão volumétrico e completada até 100 mL com água destilada..
Para a realização do teste de Voges-Proskauer, um caldo RM / VP é inoculado com o microrganismo em estudo, a partir de uma cultura pura por 18 a 24 horas..
O inóculo não deve ser muito denso. É incubado a 35-37 ° C por 24 a 48 horas, embora a incubação por vários dias às vezes seja necessária. Cowan e Steel acreditam que 5 dias é o tempo mínimo de incubação necessário para detectar todas as espécies positivas de Voges-Proskauer (VP) da família Enterobacteriaceae..
Separe uma alíquota de 1 mL em um tubo e desenvolva da seguinte maneira: Coloque 12 gotas (0,6 mL) de reagente Voges A e 4 gotas (0,2 mL) de Voges B. Misture para arejar e deixe repousar por 5 a 10 minutos antes de interpretar. No entanto, se o teste ainda for negativo, deixe-o sentar e observe o tubo após 30 minutos a 1 hora..
O aparecimento de uma cor vermelho-rosada indica que a reação de Voges-Proskauer é positiva. Se o meio permanecer amarelo, a reação é negativa.
Adicionar desenvolvedores na ordem e quantidade indicadas é essencial para evitar falsos negativos..
O teste de Voges-Proskauer é útil para diferenciar as cepas de E. coli que são VP negativos, dos gêneros Klebsiella, Enterobacter, Serratia, entre outros, que são VP positivos.
As cepas de controle podem ser usadas para testar a qualidade do meio preparado, incluindo Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium e Enterobacter cloacae ATCC 13047.
Os resultados esperados são reações de Voges-Proskauer positivas apenas para K. pneumoniae Y E. cloacae. O resto dá reações negativas.
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