O ágar M.R.S. é um meio de cultura sólido seletivo, utilizado para o isolamento e contagem de bactérias ácido-láticas, principalmente do gênero Lactobacillus. Este ágar foi criado em 1960 por Man, Rogosa e Sharpe, com o mesmo nome, mas devido à sua complexidade, a abreviatura M.R.S é frequentemente utilizada..
É composto por proteose peptona, extrato de carne, extrato de levedura, glicose, monoleato de sorbitano, fosfato dipotássico, acetato de sódio, citrato de amônio, sulfato de magnésio, sulfato de manganês e ágar..
Esta composição permite o desenvolvimento adequado de bactérias de ácido láctico a partir de amostras clínicas, como fezes, corrimento vaginal, amostras orais e leite materno, bem como laticínios e alimentos à base de carne..
Não é usado rotineiramente em laboratórios clínicos, porque as bactérias do ácido láctico raramente estão envolvidas em processos de doença. Porém, na área de microbiologia de alimentos, o uso do ágar M.R.S. é mais frequente..
Por outro lado, este meio é utilizado por alguns Centros de Pesquisa cujo objetivo é o estudo de bactérias lácticas..
Índice do artigo
O ágar Man, Rogosa e Sharpe tem uma composição bastante complexa. Ao quebrar a função de cada um de seus componentes, sua base pode ser explicada.
Proteose peptona, extrato de carne, extrato de levedura e glicose são nutrientes que fornecem a fonte de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais necessários para o crescimento bacteriano. Além disso, a glicose é a fonte de energia universal usada na maioria dos meios de cultura..
Por outro lado, para promover o crescimento de bactérias lácticas, é necessária a presença de cofatores (cátions) essenciais no metabolismo de Lactobacillus e bactérias relacionadas; estes compostos são os sais de sódio, magnésio e manganês.
Da mesma forma, o monoleato de sorbitano ou polissorbato 80 são uma fonte importante de ácidos graxos, pois são absorvidos como nutrientes..
Além disso, o monoleato de sorbitano e o citrato de amônio atuam inibindo o desenvolvimento da flora acompanhante, especialmente as bactérias Gram negativas, proporcionando o caráter seletivo desse ágar..
Por fim, o ágar-ágar é o que dá consistência sólida ao meio..
Existem outras variantes do ágar Man Rogosa Sharpe; um deles é suplementado com cisteína (M.R.S.c), muito útil para o isolamento de bifidobactérias, entre outros microrganismos. Por outro lado, existe o meio MRS suplementado com neomicina, paromomicina, ácido nalidíxico e cloreto de lítio, principalmente para a contagem seletiva de bifidobactérias em laticínios..
Pesar 68,25 gramas do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Deixe repousar por 5 minutos. Para dissolver completamente, vire para uma fonte de calor, mexendo sempre, e ferva por 1 a 2 minutos. Esterilizar em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.
Ao sair da autoclave, deixe repousar alguns minutos e distribua ainda quente em placas de Petri estéreis..
Deixe as placas solidificar e inverta as placas, peça em racks de placas e leve à geladeira até o uso. Deixe as placas atingirem a temperatura ambiente antes de usar.
O pH do meio deve ser 6,4 ± 0,2. Algumas casas comerciais recomendam pH entre 5,5 a 5,9.
O meio desidratado é bege e o preparado é âmbar escuro.
Tanto o meio desidratado quanto as placas preparadas devem ser armazenados de 2 a 8 ° C..
The M.R.S. Podem ser semeados à superfície (exaustão ou com espátula Drigalski). Também pode ser semeado em profundidade. As placas devem ser incubadas a 37 ° C em microaerofilicidade (4% Odois e 5-10% COdois) por 24 a 72 horas.
O método de semeadura é escolhido de acordo com a finalidade buscada (isolamento ou contagem).
Colônias presuntivas de Lactobacillus crescem de cor esbranquiçada e têm uma aparência mucóide ou cremosa neste ágar. Posteriormente devem ser identificados.
Para isso, a semeadura de superfície é usada. As amostras a serem semeadas requerem um procedimento prévio.
No caso de amostras de leite materno, recomenda-se centrifugar 1 ml da amostra a 14.000 rpm por 10 minutos, a fim de remover a camada de gordura. 900 µl são rejeitados e nos restantes 100 µl o sedimento é suspenso e vertido sobre a superfície do M.R.S. Em seguida, deve ser distribuído uniformemente com uma espátula Drigalski..
No caso de amostras de fezes, um (1) grama de fezes é pesado e homogeneizado em 9 mL de água peptonada estéril 0,1%, correspondendo a uma diluição de 1/10. Em seguida, diluições em série são feitas, até uma diluição final de 10-4.
Finalmente, 100 μl das 10 diluições são tomadas-dois, 10-3 e 10-4 e cada diluição é semeada em ágar MRS, distribuindo uniformemente com uma espátula Drigalski.
Neste caso a semeadura é feita em profundidade.
Para amostras de leite materno, 1 mL é retirado e colocado em um tubo plástico cônico estéril. O ágar MRS é adicionado a uma temperatura aproximada de 40 ° C até um volume final de 25 mL, obtendo-se uma mistura homogênea. Posteriormente, é despejado em placas de Petri estéreis de maneira uniforme e deixado em repouso até a polimerização..
Para amostras de fezes, são feitas diluições, conforme descrito anteriormente. Pegue 1 mL de cada diluição e coloque em tubos plásticos cônicos estéreis. Ágar MRS derretido é adicionado a um volume de 25 mL.
A mistura de cada diluição é despejada uniformemente em placas de Petri estéreis. Finalmente é deixado em repouso até sua polimerização..
A cada dia, o estudo das bactérias do ácido láctico está ganhando mais interesse; Especialmente os pesquisadores buscam conhecer novas cepas e seu potencial como fermentos iniciais para padronização na fabricação de laticínios, entre outros usos..
Nesse sentido, Alvarado et al. (2007) usou M.R.S. realizar um estudo no qual isolaram, identificaram e caracterizaram bactérias lácticas presentes em um queijo venezuelano fumado artesanal dos Andes..
No queijo encontraram a presença de bactérias dos gêneros Lactococcus e Lactobacillus, e concluíram que as misturas de cepas isoladas são adequadas como cepas iniciais na fabricação de queijos a partir de leite pasteurizado..
Por outro lado, Sánchez et al. (2017) usou M.R.S. investigar a presença de bactérias ácido-lácticas no trato digestivo de leitões, a fim de utilizá-las como probióticos nativos que aumentam a produtividade de leitões saudáveis..
Com este meio eles conseguiram isolar quatro espécies: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae Y Pediococcus pentosaceus.
Da mesma forma, Báez et al. (2019) usou M.R.S. para avaliar bactérias de ácido láctico (BAL) e bifidobactérias com potencial probiótico no leite materno e fezes infantis.
Eles conseguiram isolar 11 BAL e 3 Bifidobacteria sp no leite materno, e 8 BAL e 2 Bifidobacteria sp. nas fezes. Todos atenderam a certos parâmetros que os comprovam como bactérias com atividade probiótica.
Os autores concluíram que tanto o leite materno quanto as fezes de bebês amamentados exclusivamente servem como fontes naturais de bactérias probióticas..
Para avaliar a qualidade do M.R.S. Cepas de controle como:
Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli e Bacillus cereus.
Os resultados esperados são de crescimento satisfatório para as 6 primeiras bactérias, enquanto E. coli Y Bacillus cereus deve ser completamente inibido.
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