O Coloração May Grünwald-Giemsa o Pappenheim é uma técnica de coloração diferencial que mistura os reagentes Giemsa e May Grünwald. É utilizado para a diferenciação de células sanguíneas normais e anormais em esfregaços de sangue periférico e medula óssea, bem como para a coloração de cortes histológicos e amostras citológicas..
Ambos os reagentes -Giemsa e May Grünwald- são derivados da coloração do tipo Romanowsky, uma técnica que se baseia na combinação de corantes ácidos e básicos..
A Giemsa aprimorou a técnica ao estabilizar a mistura da eosina, do azul de metileno e seus derivados com o glicerol. Em vez disso, May Grünwald usa eosina e azul de metileno, usando metanol como solvente. Essa combinação estratégica tem rendido excelentes resultados.
Embora em termos de observação da morfologia celular atue de forma semelhante às colorações de Giemsa e Wright, essa técnica melhora as anteriores ao refinar a coloração dos parasitas causadores da malária, doença de Chagas, leishmaniose e tricomoníase..
Além disso, tem se mostrado uma técnica muito útil para o estudo citológico do líquido espermático. Tem se destacado não só por mostrar as características morfológicas dos espermatozóides, mas também por permitir a diferenciação de leucócitos, células epiteliais e células de espermatogênese com grande eficiência..
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A técnica segue a base das manchas de Romanowsky, nas quais os corantes ácidos têm afinidade seletiva para os componentes celulares básicos e os componentes ácidos atraem as manchas básicas..
Explicado de outra forma, tanto as estruturas celulares quanto os corantes têm cargas elétricas positivas ou negativas; cargas semelhantes se repelem e cargas diferentes atraem.
Por exemplo, corantes básicos como o azul de metileno têm carga positiva e são atraídos por estruturas com carga negativa. É por isso que esse corante mancha núcleos ricos em DNA e RNA que possuem grupos fosfato carregados negativamente..
Os grânulos de basófilos segmentados e os citoplasmas de leucócitos mononucleares contendo RNA também são corados..
Da mesma forma, o corante ácido carrega uma carga negativa, razão pela qual se liga a estruturas carregadas positivamente, como eritrócitos e grânulos de eosinófilos segmentados. Quanto aos grânulos dos neutrófilos segmentados, estes fixam ambos os corantes.
Nessa técnica, uma combinação de reações coexiste entre os corantes ortocromáticos e metacromáticos. Ortocromáticos (eosina e azul de metileno) ligam-se à estrutura celular à qual estão relacionados e fornecem uma cor estável que não varia.
Por outro lado, os metacromáticos (os derivados do azul de metileno azul A e do azul B) variam sua cor original uma vez anexados à estrutura específica, e pode até mesmo haver uma variedade de tons.
Por fim, o passo que a solução May Grünwald dá requer a presença de água, pois sem ela o corante penetrará nas estruturas, mas não se fixará. Para que isso aconteça, o corante deve se tornar polar ou ionizar e, assim, ser capaz de precipitar e se ligar a estruturas relacionadas..
- Lâminas de microscópio.
- Pontes de coloração.
- Solução May-Grünwald.
- Mancha de Giemsa.
- Água destilada.
0,25 g de eosina-azul de metileno (mancha segundo May Grünwald) devem ser pesados e dissolvidos em 100 ml de metanol. Em seguida, o preparo é misturado por 1 hora e deixado em repouso por 24 horas. Quando o tempo acaba, ele vaza.
Para aplicar a técnica, o corante May Grünwald deve ser diluído da seguinte forma: para 200 ml de corante diluído, medir 30 ml de solução concentrada, adicionar 20 ml de solução tampão e 150 ml de água destilada ajustada para pH 7,2-7,3. Mais tarde é misturado e filtrado.
0,5 g de azure-eosina-azul de metileno (mancha de acordo com Giemsa) devem ser pesados, dissolvidos em 50 ml de metanol e 50 ml de glicerina adicionados à mistura.
Para a realização da técnica, é diluído 1:10 com solução tampão e deixado em repouso por 10 minutos. Pode ser filtrado se necessário.
Eles devem ser pesados:
- 40 mg de di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4).
- 151 mg de hidrogenofosfato de sódio 12-hidrato (Na2HPO4).
Ambos os compostos são dissolvidos em 100 ml de água.
Existem dois modos: um clássico e um rápido.
As técnicas aqui descritas são uma orientação, mas deve-se levar em consideração que os procedimentos e tempos de coloração variam de acordo com a empresa comercial que distribui os reagentes. É aconselhável seguir os passos estritamente indicados por cada casa comercial.
1- Cubra o esfregaço com uma camada fina da solução May Grünwald por 4 minutos.
2- Retire o corante e lave com água destilada.
3- Coloque uma camada de Giemsa diluído (1:10) em água destilada por 15 minutos.
4- Retire o corante e lave com água destilada.
5- Deixe secar e observe no microscópio.
A técnica exige que os reagentes e as soluções de lavagem tenham um pH ajustado para 7,2 -7,3, para que as afinidades dos corantes pelas estruturas celulares não sejam distorcidas e a cor final esperada não varie..
Esta técnica é usada por laboratórios clínicos para corar sangue periférico e esfregaços de medula óssea, seções de tecido e citologias..
No campo hematológico, essa técnica é de vital importância no estudo das anormalidades das células em termos de forma, tamanho e número. É uma ferramenta muito valiosa para o diagnóstico de certas doenças, como leucemias e anemias.
Além disso, é de grande utilidade ao procurar parasitas em áreas hematológicas (Plasmodium sp Y Trypanosome cruzi) ou histológico (Leishmanias sp).
Em relação à citologia vaginal, esta técnica é especialmente vantajosa para a observação de Trichomonas vaginalis. Este é um achado importante, pois sua presença simula quadros de carcinoma. no local que então desaparecem quando o parasita é removido.
Tem sido uma ferramenta ideal para o estudo de amostras de esperma, pois fornece informações valiosas sobre a qualidade do esperma..
Os dados que oferece dizem respeito principalmente ao número e à morfologia, bem como às células concomitantes que podem estar presentes e que são de vital importância, como as células germinativas, os leucócitos e as células epiteliais..
Com esta análise é possível descrever as anormalidades observadas nos espermatozoides na cabeça, pescoço, peça intermediária e parte principal..
Além disso, também podem ajudar a evidenciar casos de hemospermia (presença de glóbulos vermelhos no sêmen) e leucospermia ou piospermia (aumento do número de leucócitos no sêmen).
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