O coloração de hematoxilina-eosina é uma técnica de coloração que usa a combinação de corantes hematoxilina e eosina. Este par de corantes forma uma dupla perfeita, já que a hematoxilina atua como um corante básico e a eosina é um corante ácido..
A designação de corantes básicos ou ácidos não se refere ao pH que obtêm em solução, mas antes fala da proporção predominante em termos das cargas aniônicas ou catiônicas que possuem ou pela localização do grupo cromóforo..
Nesse sentido, a hematoxilina é considerada um corante básico (catiônico) e, portanto, possui afinidade por estruturas ácidas, como o núcleo das células. Enquanto a eosina, sendo um corante ácido (aniônico), tem afinidade por estruturas alcalinas ou básicas, como o citoplasma celular.
Por esse motivo, essa combinação de corantes é amplamente utilizada para a coloração de tecidos, pois permite a distinção clara de núcleos e citoplasmas. Os núcleos coram em azul escuro ou roxo e citoplasma rosa.
A coloração pela hematoxilina-eosina é uma das técnicas de coloração mais utilizadas na área de histologia e citologia, devido ao seu fácil manuseio e baixo custo. É utilizado para a visualização de células, fibras nervosas espessas e a presença de certos microrganismos nos tecidos, tais como: parasitas, fungos e bactérias, entre outros.
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A hematoxilina é um corante neutro. Porém, o componente que fornece a cor (cromóforo) está localizado no centro catiônico ou básico da molécula. Daí sua afinidade por estruturas ácidas. Sua fórmula química é C16H14OU6 e seu nome científico 7,11b-diidroindeno [2,1-c] cromeno-3, 4,6a, 9,10 (6H) -pentol.
Ele cora principalmente os núcleos das células, por serem muito ricos em ácidos nucléicos. Também pode manchar inclusões citoplasmáticas de origem viral.
Para que a hematoxilina corante, ela deve estar em um estado oxidado e ligada a um metal. Este último servirá para se fixar ao tecido, ou seja, atuará como mordente.
Quando a hematoxilina é oxidada, é chamada de hemateina. A oxidação é obtida pela exposição ao oxigênio (envelhecimento) do reagente ou por substâncias que auxiliam na sua oxidação (oxidação química).
A eosina é um corante que se mancha de vermelho ou rosa. É insolúvel em água, embora haja uma versão solúvel em água. Geralmente, a eosina é preparada por dissolução em álcool (etanol a 95 °).
Ele cora citoplasmas, fibras musculares, organelas citoplasmáticas e colágeno, mas não cora os núcleos das células. Isso ocorre porque ele é carregado negativamente e, portanto, tem afinidade por estruturas carregadas positivamente..
Existem dois tipos de eosina "Y" e "B". A eosina "Y" é conhecida como eosina amarela. Seu nome científico é tetrabromofluoresceína e sua fórmula química é CvinteH8Br4OU5.
Por outro lado, a eosina "B" às vezes é chamada de eritrosina B azulada. Seu nome científico é dibromodinitro fl uoresceína e a fórmula é CvinteH8BrdoisNdoisOU9. Ambos são muito semelhantes e a diferença entre usar um ou outro não é realmente perceptível. No entanto, a mais popular é a eosina "Y".
A eosina tem a propriedade de distinguir entre uma célula viva e uma morta, pois só é capaz de atravessar a membrana para tingir seu citoplasma quando as células estão mortas, deixando o citoplasma da célula incolor se permanecer vivo.
Com a hematoxilina-eosina, fibras nervosas grossas podem ser coradas e identificadas. No entanto, não é útil para tingir as fibras nervosas finas, uma vez que uma coloração com prata é necessária para visualizar as últimas..
Na coloração da camada córnea da pele, o corante que atua é a eosina, já que neste nível as células não possuem núcleo..
Na camada granular da pele, a hematoxilina cora fortemente os grânulos de querato-hialina dentro das células granulares. Pelo contrário, a camada espinhosa da pele é levemente tingida com hematoxilina, enquanto a camada basal ou germinativa é tingida o suficiente.
A eosina cora o citoplasma de todas as células e a intensidade da cor pode variar de uma camada para outra..
Gómez et al., Em 2005 demonstraram que a coloração com hematoxilina-eosina foi mais eficaz na identificação de casos de amebíase devido a Entamoeba histolytica Y Entamoeba dispar do que o método de visualização fresco (solução salina e lugol) em pacientes com doença diarreica aguda.
Também demonstrou ser altamente sensível para detectar eritrofagocitose (amebas que envolveram eritrócitos).
Walwyn et al., Em 2004 propôs o uso de colorações histológicas para detectar microrganismos causadores de infecção.
Usando coloração de hematoxilina-eosina, eles foram capazes de visualizar infecções causadas por Clostridium, Actinomyces, espirilas ou Candida. Eles também conseguiram observar a presença do parasita Sarcoptes escabiei em seções de pele e inclusões virais por citomegalovírus e herpes em seções de vários tecidos.
A coloração da seção histológica passa por uma série de etapas. A primeira coisa é obter o corte histológico. Este deve ser encerado para posteriormente obter os cortes (ultrafinos) com um micrótomo. A técnica consiste nas seguintes etapas:
1-Eliminação do excesso de parafina: para isso você pode usar xilol ou Heme-D, imergir por 3-5 minutos.
2-Reidratação da amostra: Isso é feito imergindo a amostra em diferentes concentrações de álcoois (etanol) em ordem decrescente (100 °, 90 °, 70 °). Em todos os casos, por 7 minutos.
3-Eliminação do excesso de álcool: para fazer isso, ele é imerso em água por 7 minutos.
4-Coloração com hematoxilina: a amostra é imersa por 6 a 10 minutos em uma bandeja contendo hematoxilina. O tempo de exposição depende do tamanho e da espessura da amostra..
5-Eliminação do excesso de hematoxilina: É lavado com água por 5 minutos e então uma passagem rápida (10-20 segundos) em álcool ácido é realizada. Depois é lavado novamente com água por 5 minutos. Em seguida, é imerso em etanol a 96 ° por 1 minuto.
6-Coloração com eosina: para isso, a amostra é imersa por 5 minutos na bandeja de eosina.
7-Desidratação da amostra: para isso, as bandejas de álcool (etanol) são passadas novamente, mas desta vez em ordem crescente. (70 °, 90 °, 100 °). (Por 5 segundos, 5 segundos, 1 minuto respectivamente).
8-Esclarecimento da amostra: para isso, é exposto ao xilol por 5-10 minutos e seco para selar permanentemente com bálsamo do Canadá ou outro material semelhante.
Um esfregaço é feito com as fezes do paciente em uma lâmina e fixada com álcool a 80% por 5 minutos. A folha é imersa em hematoxilina por 5 minutos e imediatamente lavada com água..
Posteriormente, é rapidamente imerso em álcool ácido e, em seguida, em água com amônia. É lavado com água. É colorido por 5 minutos em eosina. A amostra é desidratada conforme explicado na técnica anterior e, finalmente, é enxaguada com xileno.
Em um litro de água destilada dissolva 50 gramas de sulfato de potássio ou amônio e alumínio. Quando completamente dissolvido, adicione 1 grama de hematoxilina cristalizada. Quando completamente dissolvido, 1 g de ácido cítrico é adicionado junto com 50 g de hidrato de cloral e 0,2 g de iodato de sódio..
A mistura é fervida por 5 minutos, depois é deixada esfriar e filtrada para remover quaisquer partículas sólidas que tenham permanecido. O reagente assim preparado pode ser usado imediatamente.
Pode ser preparado à base de álcool ou à base de água.
Em 100 ml de etanol a 95 ° dissolver 0,5 gramas de eosina "Y". Em seguida, adicione algumas gotas de ácido acético glacial.
Em 1250 ml de água destilada dissolva 25 gramas de eosina "Y" solúvel em água. Em seguida, adicione algumas gotas de ácido acético glacial.
Meça 0,5 ml de ácido clorídrico concentrado e complete a 100 ml com álcool absoluto.
Meça 0,5 mL de amônia concentrada e complete 100 mL com água destilada.
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