O contagem padrão de ágar É um meio de cultura sólido, não seletivo, destinado à quantificação da carga microbiana aeróbia presente em amostras de água potável, efluentes, bebidas lácteas, entre outros alimentos. Este meio também é conhecido como ágar PCA, por sua sigla em Inglês Plate Count Agar. Foi criado em 1953 por Buchbinder, Baris e Goldstein.
O meio de ágar de contagem padrão é composto de extrato de levedura, tripteína, glicose, ágar e água destilada. Esta formulação contém elementos nutricionais básicos que permitem o desenvolvimento da presente carga microbiana aeróbia, não exigindo.
Como o meio não contém inibidores, as bactérias podem crescer sem quaisquer restrições, tornando-o ideal para a contagem geral de colônias. No entanto, a técnica de quantificação em placa não detectará todas as bactérias presentes, mas apenas aquelas que são capazes de crescer nas condições ambientais às quais o ágar de contagem padrão semeado é submetido..
Nesse sentido, a técnica de quantificação em placa geralmente busca determinar a quantidade de bactérias do tipo aeróbio mesofílico, ou seja, aquelas que se desenvolvem em temperaturas entre 25 e 40 ° C, com temperatura ótima de crescimento de 37 ° C..
Este grupo bacteriano é muito importante, porque a maioria das bactérias patogênicas para o homem se encontra ali..
Deve-se notar que às vezes pode ser interessante quantificar a quantidade de bactérias psicrofílicas presentes nos alimentos. Essas bactérias são aquelas que se desenvolvem em baixas temperaturas (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.
Da mesma forma, as bactérias termofílicas, que se desenvolvem em uma faixa de 50 ° C a 80 ° C ou mais, podem ser importantes em certos tipos de alimentos, como alimentos enlatados..
A quantificação microbiana é expressa em unidades formadoras de colônias (CFU) por grama ou mililitro de amostra.
Índice do artigo
O meio de contagem padrão é projetado para permitir o crescimento bem-sucedido de bactérias aeróbicas não fastidiosas, uma vez que o extrato de levedura, a tripteína e a glicose fornecem os nutrientes necessários para um bom crescimento microbiano..
Por outro lado, o meio tem uma cor clara e um aspecto transparente, por isso é ideal para a visualização de colônias desenvolvidas pelo método de semeadura em profundidade (plate pouring)..
A contagem de colônias pelo método de semeadura superficial da espátula de Drigalski também é possível..
Quando a carga microbiana é alta, devem ser feitas diluições decimais da amostra em estudo para poder contar as UFCs.
Ressalta-se que esse meio é recomendado pela American Public Health Association (APHA) para a contagem de mesófilos aeróbios..
Pesar 23,5 g do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Para dissolver completamente, a mistura deve ser aquecida mexendo sempre até ferver. As próximas etapas dependem da técnica de semeadura a ser usada.
Distribua dispensando 12 a 15 ml em tubos de ensaio. Posteriormente, esterilizar em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixe solidificar verticalmente em forma de bloco. Armazenar na geladeira até o uso.
Derreta o plugue quando for usá-lo. Uma vez derretido, mantenha-o em banho-maria a 44-47 ° C enquanto as amostras são preparadas..
Esterilize o meio em autoclave a 121 ° C e distribua 20 ml em placas de Petri estéreis. Deixe solidificar, inverta e guarde na geladeira até o uso.
Tempere as placas antes de usar. O pH do meio deve ser 7,0 ± 0,2.
O Agar de contagem padrão é usado na técnica de contagem aeróbia de mesófilos durante a análise microbiológica de água e alimentos. A contagem de mesófilos aeróbios é necessária, pois determina a qualidade sanitária da amostra em estudo..
A aplicação desta técnica (utilizando este meio) permite a visualização macroscópica de colônias isoladas para sua quantificação..
A técnica consiste no seguinte:
1) Homogeneizar a amostra para redistribuir as bactérias presentes.
2) A suspensão inicial é feita em frasco ou bolsa estéril, respeitando a proporção de 10 gr ou 10 ml de amostra em 90 ml de diluente (10-1).
3) A partir da suspensão inicial, as diluições decimais pertinentes são feitas dependendo do tipo de amostra. Ex: (10-dois, 10-3, 10-4) As diluições são feitas com água peptonada ou tampão fosfato..
Para isso, pegue 1 ml da suspensão inicial e coloque em 9 ml de diluente, continue as diluições se necessário, tomando agora 1 ml da diluição 10-dois e assim por diante.
4) Pegue 1 ml de cada diluição e coloque em placas de Petri estéreis vazias.
5) Adicionar a cada placa 12 a 15 ml de ágar de contagem padrão previamente derretido e estabelecido a 44 - 47 ° C.
6) Gire suavemente as placas para distribuir a amostra uniformemente ao longo do ágar e permitir que solidifique..
7) Inverter as placas e incubar a 37 ° C em aerobiose por 24 a 48 horas.
8) Ao final do tempo, as placas são examinadas e as colônias são contadas na diluição que o permitir. As placas que têm entre 30 a 300 CFU são escolhidas para a contagem.
A contagem pode ser feita manualmente ou você pode usar o equipamento contador de colônias.
Os valores permitidos por ml de amostra podem variar de um país para outro, dependendo dos regulamentos que os regem..
O cálculo geral é feito usando a seguinte fórmula:
Expresse os resultados em 1 ou 2 dígitos, multiplicando pela base 10 apropriada. Exemplo: se o resultado for 16.545, ele será arredondado com base no terceiro dígito para 17.000 e será expresso da seguinte forma: 1,7 x 104. Agora, se o resultado fosse 16.436, arredonde para 16.000 e expresse 1,6 x 104.
-Inocular com 0,1 ml da amostra direta se for líquido, suspensão inicial 10-1 ou 10 diluições consecutivas-dois, 10-3 etc, no centro de uma placa de ágar de contagem padrão.
-Distribua a amostra uniformemente com uma espátula Drigalski ou vareta de vidro em forma de L. Deixe repousar por 10 minutos.
-Inverta as placas e incube aerobicamente a 37 ° C por 24 a 48 horas.
-Continue a contar as colônias, escolha as placas que estão em um intervalo entre 20 - 250 CFU.
Para o cálculo, é aplicado o fator de diluição, que é o inverso. O número é arredondado para 2 dígitos significativos (arredondamento de acordo com o terceiro dígito) e expresso em potência de base 10. Por exemplo, se 224 CFU forem contados na amostra sem diluição (10-1), 22 x 10 é relatado1 UFC, mas se o número fosse 225 é relatado 23 x 101 UFC.
Agora, se você contar 199 CFU na diluição 10-3, será relatado 20 x 104 CFU, mas se 153 CFU forem contados na mesma diluição, 15 x 10 serão relatados4 UFC.
O meio de cultura de contagem padrão pode ser avaliado usando cepas conhecidas certificadas, como: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.
Se o meio de cultura estiver em condições ideais, o crescimento satisfatório é esperado em todos os casos, exceto para L. fermentum que pode ter um desempenho regular.
Para avaliar a esterilidade do meio de cultura, uma ou duas placas de cada lote preparado (sem inoculação) devem ser incubadas a 37 ° C em aerobiose por 24 horas. Após este tempo, nenhum crescimento ou mudança de cor do meio deve ser observado..
-Não derreta o ágar mais de uma vez.
-O meio preparado pode durar até 3 meses, desde que mantido na geladeira e ao abrigo da luz..
-Este meio não é adequado para microrganismos fastidiosos ou anaeróbicos.
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