O teste de oxidase É um método diagnóstico que mostra a presença do complexo enzimático denominado citocromo oxidase c. Este sistema induz a transformação do citocromo reduzido a oxidado, pois captura oxigênio e este por sua vez atua como último aceptor de elétrons (H+) na cadeia respiratória.
O termo oxidase é uma forma abreviada de se referir à enzima citocromo oxidase, também conhecida como indofenol oxidase. Antigamente, acreditava-se que as enzimas citocromo oxidase e indofenol oxidase eram duas enzimas diferentes, mas hoje se sabe que são as mesmas.
Por sua vez, os citocromos são hemoproteínas que contêm ferro e completam o sistema da citocromo oxidase. Os citocromos podem variar de espécie para espécie.
Existem diferentes variedades de citocromos (citocromos a1, a2, a3 e 0). Algumas bactérias podem produzir apenas uma, mas outras até duas ou três de cada vez. Nesse sentido, a presença do citocromo ae a3 é conhecida como citocromo oxidase c. Este é o tipo de citocromo que o teste de oxidase detecta..
Os gêneros Neisseria e Pseudomonas contêm citocromo oxidase c. Esses gêneros fornecem o teste de oxidase positivo, ajudando a diferenciá-los dos gêneros Acinetobacter e Stenotrophomonas, respectivamente..
Existem também outros gêneros que são positivos para oxidase.
Índice do artigo
O sistema da citocromo oxidase c funciona da seguinte maneira: microrganismos positivos para oxidase usam oxigênio para gerar energia por meio da respiração aeróbica. Este sistema funciona graças ao transporte de elétrons de substâncias doadoras como o NADH+ para substâncias receptoras, neste caso, oxigênio.
Isso resulta na produção de energia (ATP) e água ou peróxido de hidrogênio, dependendo do sistema da citocromo oxidase que o microorganismo possui..
Por isso, a maioria das bactérias oxidase positivas também são catalase positivas, condição necessária para eliminar o peróxido de hidrogênio produzido, uma vez que essa substância é tóxica para as bactérias..
O sistema da citocromo oxidase c está presente em algumas bactérias aeróbias, algumas anaeróbias facultativas, poucas microaerofílicas e nenhum anaeróbio estrito. Este último é compreensível, uma vez que anaeróbios estritos não podem viver na presença de oxigênio, portanto, não possuem o sistema da citocromo oxidase..
Nesse teste, ele usa substâncias que atuam como aceptores artificiais de elétrons, substituindo os naturais na cadeia de transporte de elétrons..
São utilizados principalmente corantes como parafenilenodiamina e indofenol, que atuam como substratos receptores e doadores artificiais de elétrons.
A parafenilenodiamina é oxidada pelo sistema citocromo oxidase c. O corante em sua forma reduzida é incolor, mas em sua forma oxidada é colorido.
É assim que se evidencia a presença do sistema citocromo oxidase c; uma vez que uma reação positiva irá gerar uma cor lilás ou azul-púrpura dependendo do reagente usado.
Por outro lado, se a última substância aceitadora de elétrons da cadeia respiratória for diferente do oxigênio, o teste da oxidase será negativo (não há produção de cor); este é o caso dos microrganismos anaeróbios.
Da mesma forma, se o citocromo utilizado pelo microrganismo for diferente da citocromo oxidase c, também dará o teste negativo..
Existem vários reagentes e protocolos para o teste da oxidase, todos com o mesmo propósito..
Reagente de Kovacs, reagente de Gordon e McLeod, reagente de Nadi, reagente de Carpenter, Suhrland e Morrison e uso de discos de oxidase.
Consiste em 1% de dicloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina.
O reagente de Kovacs é preparado dissolvendo 1 g da referida substância em 50 ml de água destilada. É aquecido sutilmente até que esteja completamente dissolvido. Transfira para uma garrafa âmbar de capacidade suficiente e complete o volume para 100 ml com água destilada. Espere pelo menos 15 minutos antes de usar. Armazenar em uma geladeira protegida da luz.
É rotulado como reagente Kovacs oxidase, para diferenciá-lo do reagente Kovacs usado para revelar o teste de indol. Este reagente é o mais sensível, menos tóxico, mas mais caro do que o resto dos reagentes.
Uma reação positiva será evidenciada com este reagente com a mudança da cor da colônia para lilás, que rapidamente se torna roxo quase preto. A reação negativa é evidente porque não há mudança de cor na colônia ou adquire ligeira coloração rosada. O meio também pode escurecer, mas isso não significa uma reação positiva.
Com este reagente, o tempo de reação é crucial, uma mudança de cor que ocorre entre 5 a 15 segundos é considerada uma reação positiva..
É composto por dicloridrato de dimetil-p-fenilenodiamina, também conhecido como N-dimetil-p-fenilenodiamina ou monocloridrato de p-aminodimetilanilina. É preparado conforme descrito para o reagente Kovacs oxidase, em substituição à substância envolvida..
Este reagente é ligeiramente mais estável do que o reagente Kovacs oxidase, embora todos os reagentes contendo p-fenilenodiamina sejam instáveis..
Esta reação é mais tarde, é interpretada como positiva com o aparecimento de uma cor azul-púrpura dentro de 10 a 30 minutos..
É composto por 1% de α-naftol em álcool etílico (95% etanol) e 1% de aminodimetilanilina. A mistura é preparada em partes iguais e utilizando álcool etílico absoluto como diluente, até completar a quantidade suficiente para 100 ml..
É composto por oxalato de p-aminodimetilalanina a 1%. Prepare da mesma forma como descrito para o reagente Kovacs oxidase, mudando para a substância correspondente.
Com a solução pronta, prepare as tiras de teste da seguinte forma: tiras de papel de filtro Whatman No. 1 de 6-8 cm são impregnadas com 1% de reagente de oxalato de dimetil-p-fenilenodiamina.
São deixados para secar sem contato com metal, armazenados em potes com tampa de rosca com dessecante e guardados na geladeira. Essas tiras são estáveis por até 6 meses.
É o reagente mais estável de todos os citados, podendo durar até 6 meses em solução. Outro ponto positivo é que não tinge o meio ao redor da colônia, se utilizado diretamente na placa.
O aparecimento de uma cor vermelha é interpretado como um teste positivo.
São discos comerciais que são impregnados com reagente para o teste de oxidase. Existem várias marcas comerciais no mercado.
Seu uso é bastante prático, pois dispensa o preparo de reagentes frescos, o que facilita o trabalho. Os resultados obtidos são confiáveis, desde que os discos sejam devidamente preservados.
Método de placa direta, método indireto sobre papel e uso de discos impregnados com reagentes de oxidase.
2 ou 3 gotas de qualquer um dos reagentes acima mencionados são adicionadas para este fim diretamente na (s) colônia (s) contida (s) em uma placa de meio de cultura que não contém glicose..
Interpreta-se a mudança ou não de cor das colônias, não do meio. O tempo de reação válido depende do reagente usado.
Corte um pedaço de papel de filtro (Whatman No. 1) em um tamanho de 6 cmdois e colocado dentro de uma placa de Petri vazia.
Adicionar 2 ou 3 gotas do reagente Kovacs oxidase no papel, fazer parte da colônia a ser estudada com cabo de platina ou palito de madeira e espalhar em linha reta sobre o papel impregnado com reagente. Executar dentro de 5 a 10 segundos.
Com as tiras preparadas com os reagentes Carpenter, Suhrland e Morrison, uma colônia é espalhada na tira seca. Uma única tira é usada para testar várias cepas. Interprete em 10 segundos.
Umedeça sutilmente os discos comerciais com água destilada estéril e sobreponha na colônia a ser estudada. Recomenda-se a utilização das placas a 35 ° C, se forem utilizadas placas à temperatura ambiente ou refrigeradas a reação é um pouco mais lenta. Interprete a mudança de cor entre 10 a 20 segundos.
Colônias contidas em ágar sangue ou chocolate podem ser usadas.
Umedeça o disco conforme descrito anteriormente. Coloque-o em uma placa de Petri vazia. Pegue uma quantidade suficiente da colônia para estudar com um cabo de platina ou um palito de dente de madeira e coloque no disco. Interprete a mudança de cor entre 10 a 20 segundos.
Os gêneros Neisseria e Acinetobacter às vezes são muito semelhantes morfologicamente porque, embora o gênero Acinetobacter seja um bastonete Gram negativo, às vezes pode assumir a forma cocóide e se distribuir aos pares, simulando o gênero Neisseria..
Nesse caso, o teste da oxidase é muito útil. O gênero Neisseria é positivo e Acinetobacter negativo.
No entanto, o gênero Moraxella é muito semelhante ao gênero Neisseria e ambos apresentam uma reação positiva; é por isso que testes de fermentação de carboidratos devem sempre ser realizados para identificação definitiva.
Por outro lado, o teste da oxidase é útil para diferenciar uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae (todas oxidase negativas) de outros fermentadores, como o gênero Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidase positiva).
Os gêneros Vibrio e Helicobacter também são positivos para oxidase.
Use cepas conhecidas de Escherichia coli como um controle negativo e tensões de Pseudomonas aeruginosa como um controle positivo.
-Os reagentes devem ser usados preparados de fresco, sua vida útil em solução à temperatura ambiente é curta porque são muito instáveis. Refrigerados podem durar entre 5 dias a 2 semanas.
-Os reagentes são incolores, se mudarem de cor devem ser descartados. Os discos danificados são evidentes porque escurecem com o tempo.
-Uma reação positiva com o reagente Kovacs oxidase entre 15-60 segundos é considerada uma reação retardada e após 60 segundos deve ser considerada negativa.
-O Haemophylus influenzae dá uma reação de oxidase negativa se qualquer reagente com dimetil-p-fenilenodiamina for usado, mas positiva se o reagente de oxidase de Kovacs (tetrametil-p-fenilenodiamina) for usado.
-Meios contendo glicose interferem no teste, dando falsos negativos.
-Cepas de Bordetella pertussis podem dar uma reação falsa positiva se vierem de placas de ágar sangue altamente concentradas.
-O uso de cabos de metal (ferro) dá uma reação falsa positiva.
-Uma vez que os reagentes são muito instáveis e tendem a se auto-oxidar, é recomendado congelar alíquotas de 1 a 2 ml e remover conforme necessário..
-Outra forma de retardar a auto-oxidação do reagente é adicionar 0,1% de ácido ascórbico ao preparar os reagentes..
-Como os reagentes são instáveis, recomenda-se um controle de qualidade semanal..
-Os reagentes que falharem no teste de controle de qualidade não devem ser usados..
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