O teste de coagulase é uma técnica laboratorial usada para revelar a presença da enzima coagulase. Essa enzima tem a propriedade de coagular o plasma. Loeb em 1903 foi o primeiro a descrever esta enzima.
Este teste é realizado em cocos Gram positivos, catalase positiva, permitindo distinguir as cepas de Staphylococcus aureus do resto dos estafilococos, uma vez que é o único microrganismo de importância clínica que o produz.
Nesse sentido, os membros da Família Staphylococaceae com teste negativo são frequentemente referidos como Staphylococcus coagulase negativo..
Existem algumas cepas diferentes para S. aureus que pode produzir coagulase, como Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius e S. delphini.
No entanto, os três primeiros são de importância clínica a nível veterinário e muito raramente podem ser encontrados como um agente causador de infecções em humanos, enquanto S. delphini é encontrado apenas em ambientes marinhos.
Além disso, eles são facilmente diferenciados porque S. hyicus Y S. intermedius não fermentar manitol e S. schleiferi spp coagulans não fermenta maltose, nem trealose, enquanto S. aureus fermenta esses carboidratos.
A presença da enzima coagulase foi associada à virulência das cepas. No entanto, essa teoria vem caindo aos pedaços, visto que são observadas outras espécies virulentas de coagulase negativa, capazes de produzir infecções importantes..
Índice do artigo
Staphylococcus aureus produz dois tipos de coagulase, uma que permanece ligada à parede celular, também chamada de fator de aglutinação ou fator de coagulase reativo (CRF), e uma extracelular que é liberada em culturas líquidas. É por isso que são chamados de coagulase ligada e coagulase livre, respectivamente..
A enzima coagulase deve seu nome à ação que produz. Esta tem a capacidade de transformar o fibrinogênio em fibrina, criando um coágulo evidente quando encontrada no plasma, ou seja, esta enzima simula a atividade da trombina na cascata de coagulação..
Na verdade, uma das teorias mais amplamente aceitas é que a coagulase ligada reage com a coagulase livre para ativar os fatores de coagulação. Essa ativação gera uma substância que atua de forma semelhante à da protrombina, criando um composto com função da trombina..
A diferença com a cascata normal de coagulação é que esta reação não requer a presença de cálcio e não é afetada pela heparina.
Para a realização do teste de coagulase, basta enfrentar uma nova cultura de Staphylococcus com plasma preferencialmente de coelho e assim observar a formação ou não do coágulo..
Existem técnicas específicas para detectar a coagulase ligada e a coagulase ligada e livre ao mesmo tempo..
Algumas cepas de S. aureus eles dão um resultado positivo mais rápido do que outros. A taxa de formação do coágulo é diretamente proporcional à concentração de coagulase presente..
O teste de coagulase em lâmina detecta a coagulase ligada e o teste em tubo detecta a coagulase ligada e livre.
-Lâmina limpa
-Plasma de coelho de preferência, plasma humano ou de cavalo também pode ser usado. O plasma pode ser adquirido comercialmente liofilizado e reconstituído para uso ou pode ser usado fresco (fresco). Outra alternativa viável é o uso de fibrinogênio.
-Solução salina estéril (0,85%) (SSF).
Extraia sangue venoso humano ou animal. Qualquer um dos seguintes anticoagulantes pode ser usado: EDTA, oxalato de cálcio, heparina ou citrato de sódio. Misture bem e centrifugue. Remova assepticamente o sobrenadante (plasma), sem glóbulos vermelhos e coloque em um tubo estéril.
Reconstitua conforme especificado no frasco do kit comercial.
Usando plasma citratado, misture o plasma em partes iguais com uma solução saturada de cloreto de sódio. Deixe precipitar e centrifugar.
Descarte o sobrenadante, reconstitua o precipitado até 5 vezes o seu volume com água destilada estéril. Adicione 5 unidades de heparina para cada ml de fibrinogênio. Armazenar em tubo estéril.
Uma gota de solução salina e uma gota de plasma são colocadas em uma lâmina separadamente. Leve com o loop de platina 1 ou 2 colônias puras do microrganismo a ser testado.
Misture a carga bacteriana na gota de plasma e repita a operação na gota de SSF. Observe os resultados imediatamente. Um resultado positivo será aquele em que a formação de um aglutinado macroscópico (precipitado branco) é observada após um minuto no lado da gota com plasma.
A queda de SSF serve como um controle negativo. Se for observada aglutinação com SSF, isso significa que o microrganismo se autoaglutina, o que pode dar resultados falsos positivos. Neste caso, deve ser corroborado com o tubo de ensaio.
Também é recomendado montar um controle positivo com uma cepa conhecida de S. aureus.
Aglutinação dentro de 5-20 segundos (teste fortemente positivo).
Aglutinação variável ocorrendo entre 20 segundos e um minuto (teste positivo retardado).
Algum grau de aglutinação após um minuto (evidência duvidosa). Recomenda-se repetir o teste ou confirmar pelo método do tubo.
Sem aglutinação (teste negativo).
Resultado com SSF. Deve sempre dar negativo, se der positivo automaticamente o resultado do teste é invalidado.
-Tubo de ensaio estéril
-Plasma
-Banho-maria a 37 ° C.
Pipete 0,5 ml de plasma em um tubo de ensaio 12 x 75 com uma pipeta estéril. Carregue o loop de platina com 2 a 4 colônias puras para estudar a partir de uma cultura sólida por 18 a 24 horas e dissolva no plasma, misture cuidadosamente e incube a 37 ° C por 4 horas.
Examine o tubo na primeira hora sem sacudi-lo, apenas incline-o suavemente. Se ainda não houver coágulo, ele pode ser observado a cada 30 minutos até o término das 4 horas. Se após 4 horas continuar negativo, pode ser deixado por até 24 horas, mas em temperatura ambiente. Observe e relate o resultado.
Com base na experiência, alguns microbiologistas recomendam o uso de 500 µl de uma suspensão bacteriana de uma cultura de 18 horas em meio líquido para realizar o teste..
Parece oferecer resultados mais rápidos e confiáveis do que ao emulsificar colônias de meios sólidos, especialmente se o plasma humano obtido do banco de sangue foi usado..
O uso de cepas de um caldo ajuda a diluir a possível presença de anticorpos anti-estafilocócicos humanos no plasma que podem inibir a ação da coagulase..
Se for observado um coágulo envolvendo todo o fluido (coagulação completa) ou coágulo sem nada no fluido remanescente (coagulação parcial), deve ser considerado um teste positivo..
Se nenhum coágulo for formado, ou seja, a suspensão permanecer homogênea, o teste é negativo.
O fibrinogênio é usado da mesma forma que o plasma e é usado para os testes de lâmina e tubo. Proceda conforme descrito para o plasma e interprete da mesma maneira.
É usado para diferenciar o Staphylococcus aureus de estafilococos coagulase negativa.
Tenha novas culturas de uma variedade de S. aureus para ser usado como um controle positivo. Uma variedade de S. epidermidis como controle negativo.
-Um teste positivo não deve ser deixado em incubação por 24 horas, pois o S. aureus produz uma fibrinolisina que dissolve o coágulo.
-Para um teste confiável, plasma fresco ou recém-reconstituído deve ser usado, assim como é importante usar culturas bacterianas frescas (18 a 24 h). Isso evita falsos negativos.
-O teste deve ser realizado em conjunto com um controle negativo e um controle positivo.
-Alguns meios sólidos podem interferir no teste de coagulase. Não é recomendado o uso de colônias de ágar manitol salgado.
-Se for usado plasma citratado, recomenda-se colocar 5 unidades de heparina por ml de plasma para evitar falsos positivos. Isso ocorre porque alguns microrganismos diferentes de S. aureus eles podem quebrar o citrato e causar a coagulação do plasma. Neste caso, é aconselhável fazer um teste de Gram e um teste de catalase..
-É importante, no tubo de ensaio, monitorar a reação a cada 30 minutos, pois há cepas de S. aureus Eles produzem altas concentrações de fibrinolisina e diluem o coágulo recém-formado rapidamente. Evite falsos negativos.
-Ao monitorar o teste, evite agitar o tubo bruscamente, isso pode destruir o início da formação de coágulos que não será restaurada posteriormente, causando falsos negativos.
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