O meio DE ou ágar de fermentação de glicose é um ágar semissólido especialmente desenvolvido para o estudo do metabolismo oxidativo e fermentativo de carboidratos em um importante grupo de microrganismos diferentes de Enterobacteriaceae, chamados bacilos Gram negativos não entéricos.
Foi criado por Hugh e Leifson; esses pesquisadores perceberam que os meios convencionais de estudar a produção de ácido a partir de carboidratos não eram adequados para este grupo específico de bactérias..
Isso ocorre porque os bastonetes Gram negativos não entéricos geralmente produzem baixas quantidades de ácidos, ao contrário das Enterobacteriaceae..
Nesse sentido, o meio OF possui características especiais que podem detectar as pequenas quantidades de ácido formadas, tanto pela via oxidativa quanto pela fermentativa. Essas diferenças estão relacionadas à quantidade de peptonas, carboidratos e ágar..
Este meio contém menos peptonas e maior concentração de carboidratos, reduzindo assim os produtos que alcalinizam o meio pelo metabolismo das proteínas e aumentando a produção de ácidos pelo uso dos carboidratos..
Por outro lado, a diminuição da quantidade de ágar favorece a disseminação do ácido produzido pelo meio, além de permitir observar a motilidade..
O meio OF é composto de peptona, cloreto de sódio, azul de bromotimol, fosfato dipotássico, ágar e um carboidrato. O carboidrato mais comum é a glicose, mas outros podem ser usados de acordo com o que você deseja estudar, como lactose, maltose, xilose, entre outros..
Índice do artigo
Como qualquer meio de cultura, o meio OF deve conter substâncias nutritivas que garantam o crescimento bacteriano; essas substâncias são peptonas.
Por sua vez, o carboidrato fornece energia e ao mesmo tempo serve para estudar o comportamento do microrganismo contra ele, ou seja, permite que a bactéria seja classificada como um organismo oxidativo, fermentativo ou não sacarolítico..
O meio OF contém uma proporção de peptona / carboidrato de 1: 5 em oposição ao meio convencional de 2: 1. Isso garante que a quantidade de aminas alcalinas formadas a partir da degradação das peptonas não neutralize a formação de ácidos fracos..
Por outro lado, o meio contém cloreto de sódio e fosfato dipotássico. Esses compostos estabilizam osmoticamente o meio e regulam o pH, respectivamente. O azul de bromotimol é o indicador de pH, que muda a cor do meio de verde para amarelo com a produção de ácido..
Alguns microrganismos podem usar carboidratos por meio das vias oxidativa ou de fermentação, enquanto outros não seguem nenhuma das duas vias..
Isso depende das características de cada microrganismo. Por exemplo, alguns microorganismos aeróbicos estritos podem oxidar certos carboidratos, e anaeróbios facultativos podem oxidar e fermentar dependendo do ambiente ao seu redor, enquanto outros não oxidam ou fermentam carboidratos (asacarolítico).
Finalmente, há uma modificação do meio OF recomendado pelo CDC que contém uma base OF especial com vermelho de fenol como indicador..
O processo de oxidação da glicose não requer fosforilação da glicose, como o processo de fermentação. Neste caso, o grupo aldeído é oxidado a um grupo carboxila, resultando em ácido glucônico. Este, por sua vez, é oxidado a 2-cetoglucônico.
Este último ou se acumula ou se decompõe em duas moléculas de ácido pirúvico. Este sistema requer a presença de oxigênio ou algum composto inorgânico como o aceptor final de elétrons..
A produção de ácidos por esta rota é mais fraca do que a obtida pela rota de fermentação.
Para que a fermentação da glicose ocorra por qualquer uma das rotas disponíveis, ela deve primeiro ser fosforilada, tornando-se glicose-6-fosfato.
A fermentação da glicose pode seguir várias rotas, a principal delas é a rota Embden-Meyerhof-Parnas, mas também podem seguir a rota Entner-Doudoroff, ou a rota monofosfato de hexose Warburg-Dickens, também conhecida como a rota da degradação de pentoses.
A rota escolhida dependerá do sistema enzimático que o microrganismo possui..
Na fermentação da glicose pela via Embden-Meyerhof-Parnas, ela é dividida em duas moléculas de triose, para então ser degradada em vários compostos de carbono, até atingir a formação do gliceraldeído-3-fosfato. Daí se origina uma substância intermediária, que é o ácido pirúvico..
A partir daí, vários tipos de ácidos mistos serão formados que podem variar de uma espécie para outra..
Este sistema ocorre na ausência de oxigênio e requer um composto orgânico como o aceptor final de elétrons..
Na fermentação da glicose pela via de Entner-Doudoroff, a glicose 6-fosfato torna-se glucono-ᵼ-lactona-6-fosfato e, a partir daí, é oxidada a 6-fosfogluconato e 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, para finalmente forma ácido pirúvico. Esta via precisa de oxigênio para que a glicólise ocorra.
Esta rota é um híbrido das 2 anteriores. Começa semelhante à via de Entner-Doudoroff, mas posteriormente o gliceraldeído-3-fosfato é formado como um precursor do ácido pirúvico, como ocorre na via de Embden-Meyerhof-Parnas..
Pesar:
2 g de peptona
5 g de cloreto de sódio
10 g de D-glicose (ou o carboidrato a ser preparado)
0,03 g de azul de bromotimol
3 gr de ágar
0,30 g de fosfato dipotássico
1 litro de água destilada.
Misture todos os compostos exceto o carboidrato e dissolva em 1 litro de água destilada. Aquecer e agitar até dissolver completamente.
No resfriamento a 50 ° C, adicione 100 ml de glicose a 10% (filtrado).
Distribua assepticamente 5 ml de meio OF em tubos de ensaio com tampa de algodão e autoclave a 121 ° C, 15 libras de pressão por 15 minutos.
Deixe solidificar em uma posição vertical.
O pH do meio deve ser 7,1. A cor do meio preparado é verde.
Armazenar na geladeira.
O meio OF é um meio especial para determinar o comportamento metabólico de um microrganismo em relação a um carboidrato. Especialmente para aqueles que formam pouco ácido, fraco ou nenhum ácido.
Para cada microrganismo, são necessários 2 tubos OF, ambos devem ser inoculados com o microrganismo a ser estudado. A colônia é retirada com cabo reto e a punção é feita no centro do tubo sem atingir o fundo; várias punções podem ser feitas, desde que não haja interesse em observar a motilidade.
Uma camada de vaselina líquida estéril ou parafina fundida estéril (aproximadamente 1 a 2 ml) é adicionada a um dos tubos e é rotulada com a letra "F". O outro tubo permanece o original e está rotulado com a letra "O". Ambos os tubos são incubados a 35 ° C e observados diariamente por até 3 a 4 dias..
Tabela: Classificação dos microrganismos de acordo com seu comportamento em tubos OF abertos (oxidativos) e fechados (fermentativos)
O gás é observado com a formação de bolhas ou deslocamento do ágar.
Deve-se notar que um organismo que apenas oxida a glicose, mas não a fermenta, também não será capaz de fermentar outros carboidratos, em qualquer caso, apenas irá oxidá-la. Portanto, nesta situação, o tubo selado para o estudo de outros carboidratos será omitido..
Além disso, a motilidade pode ser vista no meio OF.
Motilidade positiva: crescimento que não se limita à zona de inoculação. Há crescimento nas laterais do tubo.
Motilidade negativa: crescimento apenas no inóculo inicial.
As seguintes cepas podem ser usadas como controles de qualidade: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Y Moraxella sp. Os resultados esperados são:
-Alguns microrganismos não podem crescer em meio OF. Nestes casos, o teste é repetido, mas 2% de soro ou 0,1% de extrato de levedura é adicionado ao meio..
-As reações de oxidação muitas vezes só são observadas próximo à superfície e o resto do meio pode permanecer verde, da mesma forma que é considerado positivo.
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