O Meio Löwenstein-Jensen é um meio sólido seletivo para o isolamento e desenvolvimento de bactérias do gênero Mycobacterium, como Mycobacterium tuberculosis, M. avium, entre outras, com exceção da espécie leprae, que não é cultivável.
Bactérias do gênero Mycobacterium não crescem em meios de cultura convencionais, portanto foi necessário projetar um meio especial para o seu isolamento. O meio original foi criado por Löwenstein e posteriormente modificado por Jensen.
A modificação consistiu na eliminação do corante vermelho do Congo, substituindo-o por uma concentração maior de verde malaquita. Também alterou as concentrações de citrato de magnésio e fosfato monopotássico.
O meio Löwenstein-Jensen atualmente contém amido de batata, asparagina, citrato de magnésio, fosfato monopotássico, sulfato de magnésio, verde malaquita, ácido nalidíxico, cicloheximida, lincomicina, ovos batidos, glicerina e água..
As micobactérias são normalmente isoladas de locais não estéreis, como expectoração, urina, abscessos, entre outros. Isso significa que a maioria das amostras conterá a microbiota usual da área, além do patógeno..
É por isso que o meio Löwenstein-Jensen contém em sua composição uma série de inibidores representados por verde malaquita, antibióticos e antifúngicos..
Além disso, as amostras provenientes de locais não estéreis devem ser descontaminadas e neutralizadas antes de serem semeadas em meio Löwenstein-Jensen.
Índice do artigo
A presença de ovo e glicerina no meio Löwenstein-Jensen estimula o crescimento de micobactérias, pois fornecem os ácidos graxos e proteínas necessários ao desenvolvimento desses microrganismos..
O meio Löwenstein-Jensen contém verde malaquita, que é um inibidor da microbiota que o acompanha. Mas também contém ácido nalidíxico (35 µg / mL), que inibe a microbiota Gram negativa, cicloheximida (400 µg / mL), que inibe fungos saprofíticos e leveduras, e lincomicina (2 µ / mL), que inibe a microbiota Gram positiva.
Algumas empresas comerciais preferem adicionar a seguinte combinação de antibióticos: polimixina B 200.000 unidades / L, anfotericina B 10 mg / L, carbenicilina 50 mg / L e trimetoprima 10 mg / L.
Este meio não contém ágar, portanto a solidificação do meio ocorre devido à coagulação da albumina presente no ovo durante a esterilização..
Pesar 37,3 g do meio desidratado em 600 ml de água destilada à qual foram previamente adicionados 12 ml de glicerol. A mistura é aquecida, mexendo freqüentemente até a completa dissolução. Autoclave o meio a 121 ° C por 15 minutos.
Por outro lado, uma suspensão homogênea de 1000 ml de ovos frescos deve ser preparada em condições assépticas. Adicione a suspensão de ovo aos 600 ml de meio preparado a uma temperatura de 50 - 60 ° C, evitando bolhas de ar.
Soluções antibióticas também são adicionadas após a autoclavagem..
Despeje o meio em tubos de ensaio estéreis com tampa de rosca. Aqueça os tubos a 85 ° C por 45 minutos em uma posição inclinada..
A cor do meio preparado é verde água-marinha e pode apresentar manchas esbranquiçadas devido à presença de lipídios de ovo..
O pH do meio deve ser 7,2 ± 0,2
Armazenar os tubos na geladeira e protegidos da luz direta até o uso. Temperar antes de semear.
Há uma modificação do meio chamada "modificação de Gruft do Löwenstein Jensen". Este contém os mesmos compostos que o meio clássico, mas RNA-5mg / 100 mL é adicionado, e como inibidores contém verde malaquita 0,025 g / 100 mL, penicilina 50 U / mL e ácido nalidíxico 35 ug / mL..
O meio Löwenstein-Jensen é usado para o isolamento de micobactérias de vários tipos de amostras. A coloração Ziehl-Neelsen é recomendada para qualquer amostra em que haja suspeita de presença de micobactérias..
Algumas amostras vêm de locais estéreis, mas outras não. As amostras não estéreis devem ser descontaminadas conforme apropriado:
As amostras de escarro devem ser descontaminadas da seguinte forma: determinar a quantidade de amostra de escarro em ml e adicionar a mesma quantidade de NaOH 4% à amostra e incubar a 37 ° C.
Agite a mistura freqüentemente por um período de 30 minutos. Posteriormente, centrifugue a 3000 RPM por 30 minutos.
Descarte o sobrenadante sobre uma solução desinfetante fenólica. Use o sedimento para a semeadura, mas primeiro o pH deve ser neutralizado.
Para neutralizar o sedimento, HdoisSW4 5% na presença do indicador vermelho de fenol até atingir um pH neutro que produza uma cor salmão.
Neste caso, a amostra deve ser centrifugada a 3000 RPM por 30 minutos. O sobrenadante é descartado e o pellet é usado. Para descontaminar o sedimento, adicionar 3 ml de NaOH 4% e agitar freqüentemente a 37 ° C por um período de meia hora..
Centrifugue novamente, o sobrenadante é descartado e o pellet é usado. Este último deve ser neutralizado conforme explicado na amostra de escarro..
Deixe a amostra repousar na geladeira por 24 horas. Separe o sobrenadante. O pellet restante deve ser centrifugado por 30 minutos a 3000 RMP. Rejeite o sobrenadante novamente e reconstitua o pellet com 3 ml de solução fisiológica estéril..
Adicione 3 ml de NaOH a 4% e proceda à descontaminação e neutralização conforme descrito anteriormente..
Nesse tipo de amostra ela é centrifugada e o sobrenadante é descartado. Faça um Gram no sedimento ou observe diretamente no microscópio; Se nenhuma bactéria for observada, a etapa de descontaminação não é necessária, nem a etapa de neutralização.
Neste caso, a amostra pode ser semeada diretamente com o sedimento. Se houver bactérias, proceda à descontaminação e neutralização conforme descrito acima..
A este tipo de amostra, deve-se adicionar 5 ml de água destilada para posteriormente centrifugar a 1500 RPM por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e centrifugue novamente o pellet a 3500 RPM por 30 minutos. Use o sedimento para semear o meio de cultura.
O swab deve ser colocado em um tubo estéril contendo partes iguais de água destilada e NaOH 4%. O cotonete deve ser pressionado contra as paredes do tubo para que a amostra seja diluída no líquido. Centrifugue e use o sedimento. Neutralize o sedimento conforme já descrito.
O meio Löwenstein-Jensen é inoculado pela adição de 0,5 ml da amostra na superfície do meio. Gire o tubo para distribuir a amostra por todo o meio. Não use cabo de platina.
Um segundo tubo pode ser semeado contendo meio Stonebrink com a finalidade de isolar Mycobacterium bovis e outras espécies que não crescem no meio Löwenstein-Jensen.
Os tubos inoculados são incubados aerobicamente a 37 ° C, com a tampa ligeiramente solta e inclinada a cerca de 5 ° e protegida da luz. O meio ambiente pode ser enriquecido com 5 a 10% de dióxido de carbono. Verifique as culturas duas vezes por semana até que as colônias apareçam.
Quando a amostra for absorvida, as tampas são fechadas. O tempo máximo de incubação é de 8 semanas, se após este tempo não houver crescimento, é relatado como negativo.
As seguintes cepas podem ser usadas como controle de qualidade:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045
Excelente desenvolvimento é esperado para as três primeiras espécies mencionadas, para M. fortuitum o crescimento deve ser bom, enquanto para M. bovis pouco ou nenhum crescimento é esperado. Considerando que, outras espécies que não o gênero Mycobacterium devem ser totalmente inibidas.
O meio preparado deve ser protegido da luz, a exposição prolongada à luz faz com que o meio passe de verde para azul, neste caso, o meio não pode mais ser usado. Isso ocorre porque o verde malaquita é fotossensível..
O meio, por conter ovos, pode ser facilmente contaminado se não for manuseado assepticamente. Pode ser dissolvido se contaminado com bactérias proteolíticas.
O cultivo e o manejo de bactérias do gênero Mycobacterium requerem pessoal qualificado e ciente das medidas de biossegurança que devem ser seguidas para evitar a contaminação ou contaminação de outras pessoas..
O HCl não deve ser usado na etapa de neutralização devido à formação de cloreto de sódio, que pode ser tóxico para o bacilo de Koch..
As amostras devem ser mantidas refrigeradas e protegidas da luz enquanto não estão sendo processadas..
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