O esfregaço bacteriano é uma extensão de filme fino de uma suspensão de microrganismos bacterianos que é feita em uma placa de vidro transparente ou lâmina, para observação em um microscópio óptico.
A extensão em forma de filme é realizada de forma a separar os microrganismos o máximo possível, pois se eles estão agrupados a observação não é clara..
No estudo de culturas bacterianas, técnicas de preparação, fixação e coloração de esfregaços são utilizadas para melhor analisá-las. Devido ao pequeno tamanho dos microrganismos, o uso de um microscópio óptico é necessariamente necessário para a sua observação..
Os microscópios ópticos são instrumentos indispensáveis para a observação de esfregaços. Estes utilizam lentes óticas e luz permitindo a visualização das amostras com grande ampliação..
Em geral, as células vivas não têm estruturas principalmente coloridas, vistas ao microscópio de luz são amostras incolores e transparentes, e mostram muito pouco contraste interno e com seu ambiente..
A observação com o microscópio óptico de campo claro simples, sem o uso de técnicas auxiliares de coloração, é muito limitada e só é utilizada em alguns casos, como na observação do movimento de microrganismos..
Para observação ideal de microorganismos, um equilíbrio deve ser alcançado entre contraste e resolução. Os detalhes das células não podem ser vistos ao microscópio, mesmo em alta resolução; o uso de tinturas é necessário por meio de técnicas de coloração, que fornecem contraste para observação.
Índice do artigo
Para alcançar um contraste excelente, existem microscópios sofisticados chamados microscópio de contraste de fase, microscópio de interferência diferencial e microscópio de campo escuro. Este tipo de microscópio é utilizado para observar estruturas bacterianas como bainhas e filamentos, entre outras..
A coloração é uma técnica simples para aumentar o contraste obtida com um microscópio de campo claro. Nesta técnica, diferentes corantes podem ser usados que melhoram significativamente a observação microscópica..
As manchas são realizadas diretamente sobre os esfregaços ou extensões das suspensões de microrganismos das lâminas, previamente secas e fixadas..
A fixação é uma técnica usada para preservar as estruturas celulares; provoca a inativação de microrganismos e adesão ao vidro da lâmina. Existem diferentes tratamentos de fixação: fixação por calor e fixação química.
Este é o método mais amplamente utilizado para a observação de esfregaços bacterianos. A técnica consiste em passar a suspensão bacteriana do esfregaço pela chama de um isqueiro. Essa técnica é capaz de preservar a morfologia externa das bactérias, mas destrói suas estruturas internas..
A fixação química utiliza produtos químicos de preservação, como formaldeído ou formaldeído, etanol e ácido acético, entre outros. A vantagem da utilização de fixadores químicos é que se consegue a preservação das estruturas celulares internas dos microrganismos..
Os procedimentos mais comuns para a coloração de um esfregaço previamente seco e fixo são coloração positiva ou simples, coloração diferencial e coloração negativa. Existem também técnicas especiais para a coloração de estruturas celulares específicas (cápsula, esporo, flagelo).
A coloração positiva ou simples é a técnica de esfregaço de coloração mais amplamente utilizada. Ele usa corantes que têm a capacidade de se ligar a certas estruturas microbianas, permitindo que sejam observados ao microscópio.
Esses corantes possuem grupos cromóforos (porção colorida) em sua estrutura química, com ligações duplas e simples alternadas (conjugação). Essas ligações podem, por sua vez, estabelecer ligações iônicas ou covalentes com algumas estruturas celulares..
As manchas usadas na coloração positiva ou simples são, em sua maioria, derivados químicos do anilina (sais orgânicos coloridos).
Por outro lado, entre os corantes podemos encontrar alguns com pH básico e outros com pH ácido..
Em tinturas básicas, o grupo cromóforo tem carga elétrica positiva. A grande maioria dos microrganismos procarióticos tem um pH interno neutro e sua superfície celular é carregada negativamente. Por meio dessa interação eletrostática, o cromóforo se liga à célula e a mancha.
Exemplos de corantes básicos são azul de metileno, violeta cristal, verde malaquita, fuscina básica, safranina, entre outros..
Em corantes ácidos, o grupo cromóforo tem carga elétrica negativa. Eles são usados para corar proteínas com grupos amino carregados positivamente. Exemplos de corantes ácidos são fuscina ácida, rosa bengala, vermelho do Congo e eosina.
A técnica de coloração diferencial consiste na aplicação de dois corantes de cor ou intensidade diferente, para distinguir diferentes microrganismos sob o microscópio. A coloração de Gram e a coloração de resistência ao álcool-ácido são as colorações diferenciais mais amplamente utilizadas em bacteriologia.
A coloração de Gram é usada como um teste preliminar para saber a forma, tamanho, agrupamento celular, bem como o tipo de parede celular. Usando o teste de coloração de Gram, as bactérias da parede celular são classificadas em bactérias Gram positivas e bactérias Gram negativas..
Nessa técnica, são utilizados corantes químicos que não penetram no interior da célula, mas fazem com que o meio em que se encontram os microrganismos apareça como um fundo preto..
Na técnica de coloração em negativo, o esfregaço é feito com uma gota de tinta nanquim ou suspensão de nigrosina, que após secar em temperatura ambiente forma um filme opaco à passagem da luz. Dessa forma, os microrganismos são vistos como formas brilhantes em um fundo escuro..
1.- Lave muito bem as lâminas, seque com papel absorvente e etiquete. O rótulo deve indicar o conteúdo da preparação, a data e o nome da pessoa que a processou..
2.- Acenda o isqueiro e esterilize a alça de inoculação na chama até vermelho brilhante.
3.- Deixe o cabo esfriar.
4.- Pegue o tubo de cultura bacteriana, retire a tampa e passe rapidamente a boca do tubo próximo à chama do queimador (chama).
5.- Insira a alça de inoculação no tubo contendo a cultura bacteriana e retire a amostra.
6.- Se a cultura for em meio líquido, coloque a amostra retirada com a alça no centro da lâmina e espalhe-a cuidadosamente em um círculo de aproximadamente 2 cm de diâmetro..
7.- Esterilize a alça de inoculação novamente.
8.- Deixe o esfregaço secar ao ar.
9.- Repita os passos 3 a 8 três vezes.
10.- Se a cultura for em meio sólido, deve-se colocar previamente uma gota de água destilada na lâmina. Isso é feito para misturar uma pequena amostra da cultura colhida com a alça de inoculação, conforme direcionado nas etapas 2 a 5 (condições assépticas).
11.- Espalhe a amostra diluída com a gota d'água na lâmina e repita três vezes.
1.- Adicionar duas gotas de metanol ou etanol absoluto aos esfregaços secos das culturas em meio líquido..
2.- Deixe secar ao ar longe do isqueiro.
3.- Se o esfregaço vier de uma cultura em meio sólido, o esfregaço seco é fixado com calor, passando 2 a 3 vezes rapidamente pela parte mais quente da chama do isqueiro..
4.- Tocar a parte inferior do esfregaço com a parte dorsal da mão esquerda (para destros; caso contrário, use a mão direita) e verifique se está frio.
1.- Adicionar 2 gotas da coloração selecionada ao esfregaço e deixar agir pelo tempo requerido nos protocolos específicos para cada coloração (geralmente entre 1 e 5 minutos).
2.- Algumas manchas requerem o uso de calor para a sua ativação, caso em que se deve ter muito cuidado ao aquecer a lâmina na chama do isqueiro (manipule-a com uma pinça e evite ferver). Um superaquecimento do esfregaço pode destruir as células a serem observadas..
3.- Retire o excesso de corante lavando com água destilada de uma piceta. Remova a água de lavagem batendo suavemente na lâmina em sua borda, inclinada sobre a mesa de trabalho.
4.- Permitir secagem ao ar.
5.- Dependendo do tipo de observação, utiliza-se ou não lamínula nesta fase. A lamela protege e preserva o esfregaço. Se uma observação de imersão em óleo for feita nesta fase, nenhuma lamela é usada, mas o esfregaço não pode ser preservado.
1.- Mergulhe o esfregaço sucessivamente em cada uma das soluções indicadas a seguir, por um período mínimo de 5 minutos. O objetivo desses "banhos" é deixar o esfregaço completamente desidratado. Cada reagente deve ser bem drenado antes da introdução do esfregaço no banho seguinte..
A ordem dos banhos desidratantes é a seguinte:
Em seguida, deixe secar ao ar.
2.- Monte a lamela, de preferência 22 × 22 mm, usando bálsamo do Canadá ou outro meio de montagem.
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