O caldo de ureia É um meio de cultura líquido, utilizado para evidenciar a presença da enzima urease em determinados microrganismos. A urease é uma enzima microbiana produzida de forma constitutiva, ou seja, é sintetizada independentemente da presença ou não do substrato sobre o qual atua..
A função da urease está relacionada à decomposição de compostos orgânicos. Nem todos os microrganismos são capazes de sintetizar essa enzima, portanto sua determinação em laboratório permite a identificação de certas cepas bacterianas e até a diferenciação entre espécies do mesmo gênero..
Existem dois tipos de teste de ureia: Stuart e Christensen. Eles diferem em composição e sensibilidade. O primeiro é especial para mostrar uma grande quantidade de urease produzida por espécies do gênero Proteus.
O segundo é mais sensível e pode detectar pequenas quantidades de urease geradas tardiamente por outros gêneros bacterianos, como Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter e Mycobacterium.
O caldo de ureia Stuart's é composto por uréia, cloreto de sódio, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico, extrato de levedura, vermelho de fenol e água destilada.
Enquanto isso, o caldo de uréia ou ágar de Christensen é composto de peptonas, cloreto de sódio, fosfato monopotássico, glicose, uréia, vermelho de fenol, água destilada e ágar-ágar. Este último apenas se for o meio sólido.
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A enzima urease hidrolisa a ureia para formar dióxido de carbono, água e duas moléculas de amônia. Esses compostos reagem para formar o produto final denominado carbonato de amônio..
O Caldo de Ureia de Stuart é mais tamponado com um pH de 6,8. Portanto, o microrganismo deve ser capaz de formar grandes quantidades de amônia para tornar o fenol vermelho. O pH deve subir acima de 8.
Portanto, o caldo de uréia de Stuart é seletivo para espécies de Proteus, dando resultados positivos em 24 a 48 horas de incubação, e não é eficaz para bactérias que produzem baixas quantidades de urease ou que hidrolisam a uréia lentamente..
Isso ocorre porque as espécies de Proteus são capazes de usar a uréia como fonte de nitrogênio. Em vez disso, outras bactérias produtoras de urease precisam de uma fonte adicional.
No entanto, Pérez et al. (2002) determinaram que o caldo de uréia Stuart era tão eficiente quanto o ágar uréia de Christensen, para determinar a urease em cepas de leveduras dos gêneros Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon e Saccharomyces.
Os autores do estudo afirmam ter alcançado 100% de concordância com ambos os meios (Stuart e Christensen) ao incubar por 24 e 48 horas; com a exceção de que as cepas que conseguiram transformar a mídia em uma forte cor rosa-fúcsia foram consideradas positivas.
Esse esclarecimento é necessário, uma vez que Lodder (1970) afirmou que quase todas as leveduras conseguem tornar o bisel do ágar uréia de Christensen em rosa claro. Isso se deve ao fato de poderem hidrolisar a ureia em pequenas quantidades e à formação de aminas pela descarboxilação oxidativa dos aminoácidos na superfície. Isso não deve ser interpretado como positivo.
O caldo de uréia ou ágar de Christensen é menos tamponado, sendo capaz de detectar pequenas quantidades de amônia. Além disso, este meio é enriquecido com peptonas e glicose. Esses compostos fazem crescer outros microrganismos produtores de urease que não crescem no caldo Stuart..
Da mesma forma, o teste de uréia Christensen oferece resultados mais rápidos, principalmente para Proteus, podendo dar fortemente positivo em apenas 30 minutos no mínimo e em até 6 horas no máximo.
O resto dos microrganismos produtores de urease conseguem mudar a cor do meio ligeiramente após 6 horas, e fortemente após 24, 48, 72 horas ou mais, e mesmo algumas cepas podem dar reações fracas após 5 ou 6 dias.
O meio é originalmente de cor amarelo-laranja e uma reação positiva mudará a cor do meio para rosa-fúcsia. A intensidade da cor é diretamente proporcional à quantidade de amônia produzida.
Uma reação negativa deixará o meio com a cor original, com exceção das leveduras, que podem ficar rosa pálido no meio de ágar uréia de Christensen..
Pesar as gramas necessárias de acordo com as indicações da empresa comercial. Dissolva em água destilada preferencialmente estéril. Não use calor para se dissolver, pois a ureia é sensível ao calor.
O método de filtração por membrana é usado para esterilizar. Para isso, é utilizado um filtro Millipore com poros de 0,45 µ de diâmetro. Não use autoclave. Depois que a solução é filtrada, ela é distribuída em tubos estéreis. Para obter resultados confiáveis, deve-se transferir entre 1,5 ml como quantidade mínima e 3 ml como quantidade máxima por tubo..
Guarde na geladeira e aqueça antes de usar..
Se o método de filtração não estiver disponível, o meio deve ser usado imediatamente para resultados confiáveis..
Outra maneira de preparar o Caldo de Ureia Stuart é a seguinte:
Algumas casas comerciais vendem o meio básico para o teste de uréia, sem incluir a uréia..
A quantidade indicada pela empresa comercial é pesada. É dissolvido em água destilada e esterilizado em autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. Deixe repousar um pouco e quando o meio estiver aquecido, adicionar 100 ml de uma solução de ureia preparada a 20% e esterilizada por filtração..
É distribuído em tubos estéreis, conforme descrito anteriormente.
Pesar 29 g de ureia desidratada e dissolver em 100 ml de água destilada. Use o método de filtração para esterilizar. Não autoclave.
Dissolva 24 g do ágar base desidratado em 950 ml de água destilada. Esterilize na autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixar repousar até atingir a temperatura de 50 ° C e adicionar a ureia previamente preparada assepticamente.
Despeje 4 a 5 ml em tubos estéreis e incline até ficar sólido. Deve haver um bico longo de flauta.
Este meio também pode ser preparado na forma líquida.
O teste da uréia é extremamente eficaz em distinguir o gênero Proteus de outros gêneros da Família Enterobacteriaceae, dada a rápida reação proporcionada por Proteus..
Usando a composição de Christensen, o teste ajuda a diferenciar espécies do mesmo gênero. Por exemplo, S. haemolyticus e S. warneri ssobre Estafilococo coagulase negativa e beta-hemolítica, mas eles diferem nisso S. haemolyticus é ureia negativa e S. warneri é ureia positiva.
Por outro lado, McNulty usou com sucesso o caldo de uréia a 2% de Christensen para estudar a presença de Helicobacter pylori em amostras de biópsia retiradas da mucosa gástrica (região antral).
A presença de H. pylori é evidenciado por um teste de ureia positivo. O tempo de duração para observar os resultados é diretamente proporcional à quantidade de microrganismos presentes.
Como pode ser visto, é um método simples para o diagnóstico de Helicobacter pylori em biópsias gástricas.
Finalmente, este teste também é útil para diferenciar espécies dos gêneros Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus e Mycobacteria..
Ambos os métodos requerem um inóculo microbiano forte para otimizar os resultados. As colônias bacterianas são preferencialmente retiradas do ágar sangue e leveduras do ágar Sabouraud, com algumas exceções. O inóculo é emulsificado no meio líquido.
Para o caldo de uréia Stuart, incube a 37ºC por 24 a 48 horas, sabendo que você só está procurando cepas do gênero Proteus quando a cepa for uma bactéria. Para leveduras, pode ser incubado a 37 ° C ou em temperatura ambiente por 24 a 48 horas de incubação.
No caso do caldo de uréia de Christensen, é incubado a 37ºC por 24 horas. Se o teste for negativo, pode ser incubado por até 6 dias. Se o teste der positivo antes de 6 horas, indica que é uma cepa do gênero Proteus.
No caso do ágar uréia de Christensen, o bisel do ágar é inoculado fortemente, sem punção. O caldo é incubado e interpretado da mesma maneira.
Cepas de controle, como Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium. Os dois primeiros devem dar resultados positivos e os dois últimos resultados negativos..
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