O caldo malonato É o meio de cultura líquido utilizado para o teste diagnóstico (teste do malonato), utilizado para diferenciar alguns gêneros da família Enterobacteriaceae. Foi criado por Leifson em 1933 e posteriormente modificado por Ewing, que adicionou uma pequena quantidade de dextrose e extrato de levedura à fórmula original..
O meio é atualmente composto por extrato de levedura, sulfato de amônio, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico, cloreto de sódio, malonato de sódio, dextrose e azul de bromotimol. Este teste é geralmente incluído na bateria de identificação bioquímica de Enterobacteriaceae, ajudando a diferenciar certos gêneros e espécies..
O teste do malonato baseia-se principalmente na capacidade de alguns microrganismos de usar malonato de sódio como única fonte de carbono e sulfato de amônio como fonte de nitrogênio..
O teste do malonato é geralmente positivo em algumas espécies dos gêneros Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter. Considerando que, a maioria das espécies dos gêneros Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus e Providencia apresentam reação negativa.
Índice do artigo
O teste do malonato consiste em mostrar as bactérias capazes de usar o malonato de sódio como única fonte de carbono e o sulfato de amônio como fonte de nitrogênio..
A maioria das enterobactérias que não usam malonato são capazes de crescer neste meio, tendo dextrose e extrato de levedura como nutrientes..
Nesse caso, qualquer tentativa de alcalinização pelo uso de peptonas será contrariada pela produção de ácidos gerados pela fermentação da dextrose. Da mesma forma, os fosfatos dipotássico e monopotássico atuam como tampão, mantendo o pH em 6,7.
Por isso, quando o teste é negativo, o caldo permanece com a mesma cor original (verde). Em raras ocasiões, o meio pode se tornar ácido devido à fermentação de dextrose; sem o uso das peptonas e do indicador de pH tornaria a cor do meio amarelada. Para que isso aconteça, o pH deve cair para 6.
Agora, quando esse teste é positivo, diz-se que o microrganismo utilizou o malonato e o sulfato de amônio como fontes de carbono e nitrogênio respectivamente, sem fazer uso dos demais componentes..
Nesse caso, o meio torna-se alcalino devido à liberação de sódio e consequente formação de NaOH. Nesse sentido, o indicador de pH (azul de bromotimol) muda a cor do meio de verde para azul quando o pH é igual ou superior a 7,6. O azul pode ser claro ou intenso (azul da Prússia).
Finalmente, o cloreto de sódio mantém a osmolaridade do meio e a água é o diluente de todos os componentes..
Caldo da mesma cor (verde) - Teste negativo
Caldo amarelo: teste negativo
Caldo azul claro ou profundo: teste positivo
Existe uma variante chamada caldo de malonato de fenilalanina, também chamada de meio de Shaw e Clarke. Nesse caso, dois testes podem ser analisados, o uso do malonato como fonte de carbono e a produção de ácido pirúvico a partir da fenilalanina..
Pesa-se a quantidade de gramas especificada no encarte da empresa comercial escolhida (pode variar de um para outro). Os gramas pesados são suspensos em um litro de água destilada. Aquecer ligeiramente até dissolver completamente. Distribua 3 ml do meio em tubos de ensaio 13/100 com tampas de algodão..
Esterilizar em autoclave a 121 ° C por 15 a 20 minutos.
Esfrie antes de usar. Se não forem usados imediatamente, guarde na geladeira até o uso. Traga os caldos à temperatura ambiente antes de inocular.
O pH do meio deve ser 6,7 ± 0,2. A cor do meio preparado é verde garrafa.
Pesar 11 g do meio desidratado e dissolver em 1 litro de água destilada. O resto da preparação é o mesmo descrito anteriormente.
Também pode ser preparado adicionando 2 g / L de fenilalanina ao meio caldo malonato antes de ser esterilizado..
É usado como parte da bateria de testes bioquímicos que são montados para a identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae..
Ajuda a distinguir entre:
-O gênero Klebsiella e Enterobacter (+) do gênero Escherichia e Serratia (-).
-As espécies de Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica salame ssp e Salmonella enterica ssp diarizonae (+), da espécie Salmonella enterica ssp enterica (-).
-Do gênero Klebsiella geralmente (+) do gênero Actinobacillus (-).
-Às vezes, pode ajudar a diferenciar gêneros e espécies de bactérias que não pertencem à família Enterobacteriaceae, como entre os bastonetes Gram negativos não fermentadores. Alcaligenes faecalis (+) e Acinetobacter sp (-).
Sob um isqueiro, uma porção de uma colônia pura é retirada, usando um cabo de platina devidamente esterilizado e resfriado. A amostra retirada (inoculo leve) é dissolvida no caldo de malonato. Incube com a tampa solta em aerobiose a 35 ° C ± 0,2 por 24 a 48 horas.
O caldo malonato também pode ser inoculado a partir de uma cultura de 18-24 horas em caldo de tripticase de soja. Neste caso, com uma pipeta estéril retira 0,01 ml e inocula-se o caldo malonato. Incube com a tampa solta em aerobiose a 35 ° C ± 0,2 por 24 a 48 horas.
No final do tempo, os resultados são interpretados. Qualquer vestígio de cor azul após 48 horas de incubação deve ser considerado positivo. O teste não deve ser interpretado como negativo antes de decorrido o tempo de incubação de 48 horas..
No caso de usar a variante do caldo de malonato de fenilalanina, o malonato é primeiro interpretado e, em seguida, são adicionadas 5 gotas de HCl 1N e 3-5 gotas de cloreto férrico a 8%. Uma cor verde escura é interpretada como um teste positivo para fenilalanina. Se, pelo contrário, o meio ficar azul claro, o teste é negativo para fenilalanina..
Para realizar o controle da esterilidade do meio, um ou dois caldos devem ser incubados a 35 ° C ± 0,2 por 24 horas de incubação. Após este tempo, não deve haver turvação ou mudança de cor.
Cepas conhecidas ou certificadas podem ser usadas para controle de qualidade, como: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 e Escherichia coli ATCC 25922.
Os resultados esperados são:
Não use caldos que apresentem turvação, precipitados, mudança de cor ou qualquer sinal de deterioração.
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