O Agar Thayer Martin é um meio sólido altamente nutritivo e seletivo para o isolamento de Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae; ambos conhecidos como Neisserias patogênicas ou clinicamente importantes.
Uma das características especiais mais importantes do Agar Thayer Martin é o seu alto teor de suplementos nutricionais. Esta propriedade é essencial, pois as Neisserias são microrganismos muito exigentes do ponto de vista nutricional e por isso não crescem em meios comuns..
Por outro lado, como esses microrganismos são normalmente encontrados em áreas não estéreis, é necessário adicionar inibidores que impeçam o crescimento da flora acompanhante, sem afetar o desenvolvimento do gênero Neisseria..
Este ágar é composto de ágar base GC, hemoglobina, suplementos nutricionais adicionais e um complexo de substâncias inibidoras (antibióticos e antifúngicos). As casas comerciais vendem cada um dos suplementos separadamente.
A amostra a ser semeada neste meio dependerá do microrganismo que se busca. A fim de Neisseria gonorrhoeae as amostras ideais são as secreções vaginais e uretrais. Enquanto por Neisseria meningitidis as amostras mais utilizadas são líquor, exsudato faríngeo e nasofaríngeo.
Índice do artigo
Neisserias são microrganismos classificados como incômodos e, portanto, seu isolamento é difícil. Por isso, Thayer Martín é um meio complexo e cada um de seus componentes cumpre uma função que é explicada a seguir:
O ágar GC contém peptona de proteose, amido de milho, cloreto de sódio, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico e ágar-ágar. Seus componentes fornecem os nutrientes básicos para o desenvolvimento microbiano, neutralizam os ácidos graxos tóxicos, ajudam a manter o equilíbrio osmótico, definem o pH e fornecem consistência sólida ao meio..
A hemoglobina fornece os fatores V e X (nicotinamida adenina dinucleotídeo NAD e hemina, respectivamente). Por esta razão, as espécies Haemophilus também crescem neste meio. A hemoglobina pode ser obtida comercialmente na forma desidratada ou sangue bovino desfibrinado fresco pode ser adicionado ao meio..
Por outro lado, um suplemento de enriquecimento também deve ser adicionado ao meio Thayer-Martin, uma vez que os nutrientes contidos no ágar base não são suficientes para as necessidades do gênero Neisseria..
O suplemento de enriquecimento mais comumente usado é chamado isovitalex. Ele contém glutamina, adenina, NAD, cocarboxilase, guanina, nitrato férrico, ácido p-aminobenzóico, vitamina B12, tiamina e glicose. Todos esses compostos são necessários para o desenvolvimento adequado de Neisserias patogênicas..
Por ser um meio altamente nutritivo, devem ser utilizados inibidores que impeçam o crescimento de microrganismos da flora usual da região e, assim, favoreçam o isolamento do gênero Neisseria..
O complexo inibidor é composto de vancomicina, colistina e nistatina. A vancomicina inibe o crescimento de bactérias Gram positivas, a colistina impede o crescimento de bactérias Gram negativas, como Pseudomonas e algumas Neisserias saprófitas, e a nistatina atua nas leveduras como Candida albicans.
No entanto, Thayer Martin Agar foi modificado posteriormente; as mudanças consistiram na adição de trimetoprima, no aumento da quantidade de ágar e na adição de glicose extra. Essas mudanças melhoraram significativamente a recuperação das espécies de Neisseria gonorrhoeae.
Deve-se notar que o trimetoprim inibe o crescimento do gênero Proteus e sua consequente formação de enxameação. Nesse sentido, antibióticos são aqueles que conferem caráter seletivo ao meio Thayer Martin..
Pesar 8,2 g de meio GC desidratado e suspender em 100 ml. Misture e ferva por 1 minuto, mexendo sempre, para dissolver completamente. Esterilize a mistura em uma autoclave a 121 ° C por 15 minutos.
Suspender 2 g de hemoglobina desidratada em 2 ou 3 ml de água destilada quente até que se forme uma mistura uniforme. Adicione mais água aos poucos para fazer um volume de 100 ml. A suspensão deve ser homogênea antes da esterilização.
Esterilize em autoclave por 15 minutos.
Reconstitua o frasco comercial com o diluente fornecido pela mesma empresa comercial. Misture bem. A quantidade de diluente a usar será especificada nas instruções do kit..
Reconstitua o frasco com o diluente fornecido pela empresa comercial. Misture bem. A quantidade de diluente a ser usada será especificada nas instruções do kit..
Para cada 100 ml de ágar GC, proceda da seguinte forma:
Quando o ágar GC sair da autoclave, deixe esfriar a uma temperatura de aproximadamente 50 ° C e adicione 2 ml da solução de hemoglobina preparada, 2 ml do suplemento de enriquecimento (isobitalex ou britalex) e 2 ml do suplemento de inibição. Misture e sirva em placas de Petri esterilizadas..
Deixe solidificar e guarde na geladeira até o uso.
A cor do meio preparado é vermelho cereja. O pH final do meio é 7,2 ± 0,2
Pesar 8,2 g de meio GC desidratado e suspender em 100 ml. Adicione 1 g de ágar-ágar e adicione 0,3 g de glicose. Misture e ferva por 1 minuto, mexendo sempre, para dissolver completamente. Esterilize a mistura em uma autoclave a 121 ° C por 15 minutos.
Prepare a hemoglobina e o suplemento de enriquecimento conforme descrito acima.
O suplemento de inibição usado é V.C.N.T (vancomicina, colistina, nistatina, trimetoprima).
Proceda conforme descrito para o ágar Thayer Martin original.
O Agar Thayer Martin deve aquecer antes de as amostras serem semeadas. As amostras comumente usadas são esfregaços faríngeos, esfregaços nasais, secreção vaginal, uretral e / ou retal e LCR..
Use amostras frescas e faça inóculos fortes no ágar. As amostras são semeadas diretamente por descarga de material e, em seguida, estrias de depleção na superfície.
As placas são incubadas a 35-37 ° C por 24 a 48 horas em um frasco microaerofílico (5% COdois) No final do tempo de incubação, as placas são examinadas em busca de pequenas colônias, de cor cinza e às vezes de aparência mucóide..
Realizar testes bioquímicos de Gram e confirmatórios em colônias suspeitas.
As seguintes cepas microbianas podem ser usadas para realizar o controle de qualidade no Agar Thayer Martin.
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 e Neisseria meningitidis ATCC 13090; o desenvolvimento satisfatório é esperado em ambas as cepas.
As seguintes cepas também devem ser incluídas: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 e Candida albicans ATCC 10231. Em todos eles espera-se uma inibição total ou parcial neste meio..
-Deve-se ter em mente que bactérias resistentes aos inibidores usados podem crescer no meio..
-Existem variedades de Neisseria gonorrhoeae que pode ser sensível à concentração de vancomicina utilizada. Por esse motivo, recomenda-se o uso de ágar chocolate suplementado com isovitalex, mas sem inibidores..
-Existem cepas de leveduras resistentes à nistatina que podem crescer neste meio e interferir no isolamento de Neisserias patogênicas, especialmente gonococos..
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