Justificativa, preparação e uso do Agar TCBS

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Anthony Golden

O Ágar TCBS é um meio de cultura sólido altamente seletivo e diferencial, utilizado para o isolamento e cultivo de bactérias do gênero Vibrio, principalmente Vibrio cholerae, V. vulnificus Y V. parahaemolyticus como os principais patógenos deste gênero.

A sigla TCBS significa Tiosulfato Citrato Bile Sacarose. Este ágar também é conhecido como meio seletivo para Vibrios. A fórmula original foi criada por Nakanishi e posteriormente modificada por Kobayashi.

Meio TCBS comercial e placa de ágar TCBS semeada com Vibrio cholerae. Fonte: foto 1: tirada pelo autor MSc. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Índia [domínio público]

É composto por extrato de levedura, peptona de carne, tripteína, citrato de sódio, tiossulfato de sódio, bile de boi, sacarose, cloreto de sódio, citrato férrico, azul de bromotimol, azul de timol e ágar..

Esta composição permite um desenvolvimento adequado de espécies de Vibrio a partir de amostras de água, alimentos e fezes; exceto Vibrio hollisae, que não cresce neste ambiente. Além disso, o meio TCBS é capaz de inibir o crescimento de outras bactérias acompanhantes, especialmente coliformes..

Devido aos graves problemas gastrointestinais e extra-intestinais que algumas espécies do gênero Vibrio produzem, seu diagnóstico é muito importante. Os humanos são infectados principalmente pelo consumo de alimentos crus ou malcozidos do mar ou de águas poluídas, mas também por infecção de feridas.

Por isso, os laboratórios clínicos devem incluir o ágar TCBS no estudo da cultura de fezes de amostras de fezes líquidas, especialmente com o aparecimento de água de arroz. Principalmente se o paciente relatar ter entrado em contato com água do mar ou consumido mariscos ou peixes.

Índice do artigo

  • 1 justificativa
  • 2 Preparação
  • 3 Use
  • 4 semeados
  • 5 Limitações
  • 6 Controle de qualidade
  • 7 referências

Base

Extrato de levedura, peptonas de carne e tripteína são a fonte nutricional deste meio. No entanto, o ágar TCBS é um meio inóspito para a maioria das bactérias..

Sua alta seletividade é dada pela adição de citrato de sódio e bile de boi; ambos são agentes inibidores que também fornecem um pH alcalino ao meio, restringindo o crescimento da flora acompanhante e favorecendo o crescimento de V. cholerae, entre outras espécies. Cabe ressaltar que Vibrio cholerae é muito sensível à acidez.

Por sua vez, o cloreto de sódio equilibra osmoticamente o meio. Além disso, como sua concentração é elevada, também atua como um agente inibidor, favorecendo o crescimento de bactérias halofílicas..

A sacarose é o açúcar fermentável que, juntamente com os indicadores de pH azul de bromotimol e azul de timol, conferem ao meio seu caráter diferencial. Por este motivo, com este meio é possível diferenciar cepas fermentadoras de sacarose das não fermentadoras..

Colônias de cepas de fermentação de sacarose desenvolvem cor amarela e irão transformar o meio de verde para amarelo pela produção de ácido. Os não fermentadores tornam-se translúcidos e o meio permanece com a cor original (verde).

Da mesma forma, este meio contém tiossulfato de sódio como fonte de enxofre e citrato férrico como agente de desenvolvimento. Ambos apresentam bactérias capazes de produzir sulfeto de hidrogênio (gás incolor). O HdoisS é formado a partir de tiossulfato e, subsequentemente, ao reagir com citrato férrico, forma-se um precipitado preto visível..

Por fim, o ágar é aquele que confere consistência sólida ao meio..

Preparação

Pesar 89 g do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Ajuda na dissolução aquecendo e mexendo frequentemente. A mistura pode ser fervida por até 2 minutos..

Este meio não é autoclavado. Depois de dissolvido, é servido diretamente em pratos esterilizados. Quando solidificam, são dispostos de forma invertida em placas e armazenados em geladeira (2-8 ° C) até o uso..

O meio após a preparação deve permanecer em pH 8,6 ± 0,2.

A cor do meio desidratado é bege claro ou bege-esverdeado, e a cor do meio é verde floresta ou verde azulado.

É importante permitir que as placas aqueçam antes de semear as amostras..

Usar

A amostra mais comum para isolamento de Vibrios são fezes diarreicas..

As amostras de fezes, se não puderem ser semeadas imediatamente no meio seletivo, devem ser transportadas no meio Cary Blair..

Para aumentar a sensibilidade da cultura, as fezes podem ser passadas em água peptonada a pH 8,4 como meio de enriquecimento por no máximo 8 horas, a partir daí são subcultivadas para o meio TCBS..

Também deve ser levado em consideração que algumas cepas de Vibrios podem causar septicemia em pacientes imunossuprimidos, portanto, podem ser isoladas em hemoculturas. Da mesma forma, amostras de água e alimentos do mar podem ser analisadas quando há surtos epidêmicos da doença de cólera..

Semeado

O inóculo da amostra em estudo deve ser proeminente, a semeadura é realizada pelo método de estriação por exaustão. As placas são incubadas a 37 ° C por 24 horas em aerobiose.

As presumíveis colônias de Vibrio cholerae eles são de tamanho médio, lisos, opacos, de bordas finas e de cor amarela devido à fermentação da sacarose.

Da mesma forma, a espécie de V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii e alguns V. vulnificus. Outras espécies de Vibrios clinicamente importantes, como V. parahaemolyticus não fermentam a sacarose, desenvolvendo-se como colônias de verde oliva.

Placa de ágar TCBS semeada com Vibrio parahaemolyticus. Fonte: isis325 Flickr

Por outro lado, deve-se ter em mente que algumas cepas de Aeromonas e Plesiomonas que são oxidase (+) podem crescer neste meio, desenvolvendo colônias amarelas que podem confundir o clínico. Enquanto algumas cepas de Pseudomonas também oxidase (+) crescem como colônias verdes, assim como V. parahaemolyticus.

Limitação

O teste da oxidase positivo para o gênero Vibrio nunca deve ser realizado em colônias obtidas com ágar TCBS, pois o resultado obtido será um falso negativo. Os compostos intermediários interferem fortemente neste teste. Portanto, deve ser realizado a partir de subculturas em ágar sangue..

Controle de qualidade

Para comprovar que o meio está em bom estado, é aconselhável semear linhagens controle conhecidas ou certificadas e observar se o crescimento atende às características esperadas..

Para isso, você pode usar cepas de:

-Vibrio cholerae - crescimento satisfatório (colônias amarelas, borda translúcida).

-Vibrio parahaemolyticus - crescimento satisfatório (colônia com centro verde e borda translúcida).

-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - crescimento satisfatório (colônias amarelas com halos da mesma cor ao redor da colônia).

-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - inibição total ou parcial (pequenas colônias amarelas ou translúcidas).

-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - inibição parcial ou total (colônias azuis).

-Escherichia coli ATCC 25922 - Completamente inibido.

-Proteus mirabilis ATCC 43071 - Inibição total ou parcial. (Pequenas colônias verdes com borda translúcida).

A incubação do meio não inoculado deve ser inalterada.

Referências

  1. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. Ágar TCBS. 2009. Disponível em: f-soria.es
  2. Laboratório BD. BD. TCBS Agar 2003. Disponível em: bd.com
  3. Britannia Laboratories. TCBS Medium. 2015. Disponível em: britanialab.com
  4. Acumedia Laboratories. Agar TCBS. 2016. Disponível em: foodsafety.neogen.com
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  6. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.

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